[发明专利]检测慢性粒细胞白血病的单链DNA适配子及其制备方法

权利要求书

1.一种检测慢性粒细胞白血病的单链DNA适配子，其特征在于：该适配子具有序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.5所述的核苷酸序列的任意一种。

2.根据权利要求1所述的一种检测慢性粒细胞白血病的单链DNA适配子，其特征在于：

所述SEQ ID No.1所述的核苷酸序列的二级结构为：

所述SEQ ID No.2所述的核苷酸序列的二级结构为：

所述SEQ ID No.3所述的核苷酸序列的二级结构为：

所述SEQ ID No.4所述的核苷酸序列的二级结构为：

所述SEQ ID No.5所述的核苷酸序列的二级结构为：

3.一种如权利要求1所述的检测慢性粒细胞白血病的单链DNA适配子的制备方法，其特征在于：该方法按照下列步骤进行：

①将慢性粒细胞白血病K562细胞接种于含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中，置于37℃、饱和湿度、5％CO₂的培养箱内培养，隔天传代一次；

②构建单链DNA文库：

5’-ATACCAGCTTATTCAATT-N52-AGA TAGTAAGTGCAATCT-3’，

其中N代表碱基A、G、C、T中的任意一个，构建5条引物，分别为：

P1    5’-ATACCAGCTTATTCAATT-3’

P2    5’-FITC-ATACCAGCTTATTCAATT-3’

P3    5’-Dig-ATACCAGCTTATTCAATT-3’

P4    5’-Bio-AGATTGCACTTACTATCT-3’

P5    5’-AGATTGCACTTACTA TCT-3’

③将10μg的随机ssDNA文库加到400μl 2×结合缓冲液中，于99℃变性5min，然后立即置于0℃冰上10min；加入3％BSA 13.5μl降低背景；再将1×106个人慢性粒细胞性白血病K562细胞加到上述溶液中混匀，37℃水浴30min；3000rpm离心5min，去上清，加入400μl结合缓冲液混匀再3000rpm离心5min，反复6次；最后所得沉淀加入100μl ddH₂O，100℃加热10min；10000rpm离心5min，取上清，经酚：氯仿抽提，乙醇沉淀，将ssDNA溶解于20μl TE缓冲液中；

④将上述筛选过程得到的ssDNA，用上游引物P1和下游生物素标记的引物P4经PCR扩增成一端带生物素的dsDNA，PCR反应体系为：模板mμl，10×PCR Butter 5μl，MgCl₂3μl，dNTPs 5μl，Taq DNA多聚酶2U，上游引物、下游5’端生物素标记的引物各25pmol，加去离子水至50μl；PCR反应条件为：94℃预变性2min，然后进行n个循环94℃的变性30s，45℃退火1min，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min；在开始几轮筛选过程中，ssDNA文库和细胞量投放很多；在随后的几轮筛选中，由于高特异性的适配子已经富集，为了提高筛选的严谨性，结合时间由30min减少到20min；模板量也由2μl减少到0.5μl；然而PCR循环数却由原来的11个循环增加到16个循环；

⑤PCR扩增产物电泳鉴定及纯化：用含有浓度0.25μl EB的3％的琼脂糖凝胶，将每轮筛选产物的PCR产物中，取5-10μl上样于80V，进行电泳，30min后取出凝胶，用凝胶图像分析系统观察并照相，PCR产物用UNIQ-10柱式PCR产物回收试剂盒纯化；

⑥磁珠分离制备次级文库：取100μl磁珠于1.5ml微量离心管中置磁力架1～2min，吸弃上清；拿下微量离心管，加入100ul 2×洗涤缓冲液重悬磁珠；重置磁力架1～2min，吸弃洗涤缓冲液，加入200μl 2×洗涤缓冲液，再加入200μl生物素化的dsDNA 37℃水浴15min；上磁力架1～2min，吸弃上清；用200μl 1×洗涤缓冲液冲洗2～3次；加入50μl 150mM NaOH于37℃水浴15min，使dsDNA解链；上磁力架，含生物素的一条ssDNA仍留在链霉亲和素磁珠上并吸附于管壁，而另一条不含生物素的ssDNA则存在于上清中，分离出上清中的ssDNA并测定A值，此即为下一轮筛选的ssDNA库；

⑦中性粒细胞进行反筛：用中性粒细胞提取液从正常查体人群血液中提取中性粒细胞，将磁珠分离得到的ssDNA库99℃加热5min进行变性，然后立即置于0℃ 10min；将1×106个中性粒细胞上清后加入上述溶液，加入选择缓冲液400μl 37℃水浴30min；将混合液3000rpm离心2min，取上清，用于下一轮SELEX筛选；

⑧适配子克隆测序及一级、二级结构的分析：重复筛选13轮后，将筛选得到的适配子回收纯化后连接pGEM-T质粒载体，经蓝白筛选后，随机挑选24个克隆子进行序列测定；并用DNAMAN软件对适配子序列进行一级结构同源性分析和二级结构预测；

⑨克隆适配子与靶细胞亲和力的测定：将标准品5’-FITC-88nt-3’用选择缓冲液稀释为不同浓度的溶液，测定各管的荧光强度，绘出荧光强度-ssDNA浓度标准曲线；取测序之转化菌，经质粒抽提试剂盒抽提后，用标记荧光素和生物素的引物进行PCR扩增，然后再用生物素-链霉亲和素磁珠分离，得到标记有荧光素的单链DNA，测定其荧光强度；按荧光素标记的ssDNA∶慢性粒细胞性白血病K562细胞＝50pmol∶1×106个慢性粒细胞性白血病K562细胞的比例进行结合反应，将二者在选择缓冲液中结合30min，更换离心管，离心，吸取上清测定荧光强度；用选择缓冲液重悬慢性粒细胞性白血病K562细胞后离心，吸取上清，测定荧光强度，重复洗涤2次，洗去未与慢性粒细胞性白血病K562细胞结合的荧光素-ssDNA；根据各管洗涤上清的荧光强度从标准曲线查得其对应的浓度，乘体积得到ssDNA的量，再将各管的量相加，即为未结合到慢性粒细胞性白血病K562细胞上的ssDNA的总量；将投入总量减去未结合的量即为结合到慢性粒细胞性白血病K562细胞上的ssDNA的量，用结合的量除以总量，计算出结合率；用同样的方法测定适配子与人正常中性粒细胞的结合率；与慢性粒细胞性白血病K562细胞结合率较高，而与人正常中性粒细胞结合率低的就是能与慢性粒细胞性白血病细胞特异性结合的DNA适配子。