[发明专利]黄瓜绿斑驳花叶病毒一步RT-PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种黄瓜绿斑驳花叶病毒一步RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，属于生物技术领域，专用于口岸检验检疫和农业植检部门对黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测。

背景技术

黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)属于烟草花叶病毒属(Cucumber green mottle mosaicvirus，Tobamovirus)成员，病毒基因组为正单链RNA，全长约6.5kb。CGMMV以西瓜(Citrulluslanatus)、黄瓜(Cucumis sativus)、甜瓜(Cucumis melo)、瓠子(Iagenaria siceraria)、南瓜(Cucurbita moschata)等葫芦科作物为主要寄主。CGMMV目前主要分布在欧洲、亚洲和南美洲，包括英国、德国、荷兰、丹麦、俄罗斯(前苏联)、希腊、奥地利、捷克斯洛伐克、芬兰、南斯拉夫、罗马尼亚、波兰、匈牙利、西班牙、瑞典、乌克兰、拉托维亚、日本、印度、韩国、巴基斯坦、以色列、沙特阿拉伯、伊朗、巴西及中国等国家。CGMMV具有很强的传染性和稳定性，是一种危害比较大的病毒，可以造成葫芦科作物严重减产。据报道，前苏联的Georgia地区，CGMMV发生率曾经达80％-100％，使得西瓜减产30％(Medvedskaya I G，Zashchita Rastenii，1981，5：44-45)。2004年，CGMMV在巴基斯坦南部葫芦上发生率达46.9％，引起的产量损失严重(Ali et al.，Journal of Phytopathology，2004，152(11)：677-682)。2005年，我国辽宁省盖州市西瓜染病面积达333hm²，其中13hm²绝收(古勤生，中国瓜菜，2007，(1)：47-48)。鉴于CGMMV的危险性，口岸迫切需要加强该病毒的检测，以防止该病毒传播、扩散和危害。

目前，用于植物病毒检测的方法主要包括指示植物法、电镜法、血清学法和分子生物学法。CGMMV可通过接种苋色藜、曼陀罗、矮牵牛等指示植物来鉴定，但与同属其他病毒表现的症状十分相似，因而可靠性不高，并且检测周期长。电镜法检测CGMMV不仅需要特殊的仪器设备，而且材料前处理较为复杂。血清学检测具有所需设备简单、操作简便、成本低廉和反应灵敏的优点，但在样品量极少或病毒在组织中含量很低时，用血清学方法检测仍难以检出。与血清学检测方法相比，基于核酸水平的RT-PCR分子检测方法具有灵敏度更高、特异性更强、结果更可靠等显著优点，但到目前为止，尚未见有关CGMMV一步RT-PCR检测试剂盒及其检测方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄瓜绿斑驳花叶病毒一步RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，用于进出境葫芦科植物及产品上黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检疫鉴定。

本发明技术方案如下：

(一)一种黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)一步RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)A^#管，内装黄瓜绿斑驳花叶病毒的上游引物，浓度为10μmol/L，引物序列为5’-TGCTTCTTATGTTCCCGTCA-3’；

2)B^#管，内装黄瓜绿斑驳花叶病毒的下游引物，浓度为10μmol/L，引物序列为5’-GCCCATAGAAACTTCAACGTC-3’；

3)C^#管，内装PCR Buffer，浓度为10×；

4)D^#管，内装Mgcl₂，浓度为25mmol/L；

5)E^#管，内装dNTPs，浓度为10mmol/L；

6)f^#管，内装RNA酶抑制因子，浓度为40U/μL；

7)G^#管，内装反转录酶，浓度为5U/μL；

8)H^#管，内装DNA聚合酶，浓度为5U/μL；

9)I^#管，内装含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的阳性对照CK+；

10)J^#管，内装不含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的阴性对照CK-；

11)K^#管，内装RNase-free ddH₂O。

(二)上述黄瓜绿斑驳花叶病毒一步RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：