[发明专利]黄瓜绿斑驳花叶病毒一步RT-PCR检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种黄瓜绿斑驳花叶病毒一步RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)A^#管，内装黄瓜绿斑驳花叶病毒的上游引物，浓度为10μmol/L，引物序列为5’-TGCTTCTTATGTTCCCGTCA-3’；

2)B^#管，内装黄瓜绿斑驳花叶病毒的下游引物，浓度为10μmol/L，引物序列为5’-GCCCATAGAAACTTCAACGTC-3’；

3)C^#管，内装PCRBuffer，浓度为10×；

4)D^#管，内装Mgcl₂，浓度为25mmol/L；

5)E^#管，内装dNTPs，浓度为10mmol/L；

6)F^#管，内装RNA酶抑制因子，浓度为40U/μL；

7)G^#管，内装反转录酶，浓度为5U/μL；

8)H^#管，内装DNA聚合酶，浓度为5U/μL；

9)I^#管，内装含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的阳性对照CK+；

10)J^#管，内装不含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的阴性对照CK-；

11)K^#管，内装RNase-free ddH₂O。

2.根据权利要求1所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒一步RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述A^#管-K^#管分别为1管，其中A^#管的含量为100μL；B^#管的含量为100μL；C^#管的含量为150μL；D^#管的含量为300μL；E^#管的含量为150μL；F^#管的含量为25μL；G^#管的含量为25μL；H^#管的含量为25μL；I^#管的含量为50μL；J^#管的含量为50μL；K^#管的含量为1mL。

3.根据权利要求1所述黄瓜绿斑驳花叶病毒一步RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)根据待检测样品的数量，在每PCR管内加入A^#液2μL、B^#液2μL、C^#液5μL、D^#液10μL、E^#液5μL、F^#液1μL、G^#液1μL、H^#液1μL和K^#液21μL，混匀、瞬离后备用；

2)RT-PCR反应：取待检测样品、阴性对照和阳性对照RNA模板各2μL，分别加入步骤1)配制好的各PCR管内，混匀、瞬离后进行以下的RT-PCR反应：先42℃cDNA合成30min，接着94℃预变性5min，之后进入以下循环：94℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后一轮循环之后再72℃延伸10min；

3)PCR扩增产物电泳检测：RT-PCR反应结束后，取产物10μL，用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果。

4.根据权利要求3所述黄瓜绿斑驳花叶病毒一步RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于：含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的样品电泳检测结果为在567bp处出现明亮的DNA条带。