[发明专利]一种降血压肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种降血压肽，尤其是涉及一种采用全自动发酵罐进行高密度发酵的降血压 肽的制备方法。

背景技术

高血压是一种高发病率、多并发症的危险疾病，正严重危害着人类身体健康和生活质量。 高血压发病机制复杂多样，肾素-血管紧张素调节系统(RAS)调节机制失衡是高血压发病的 重要机制之一。血管紧张素转化酶(ACE)在该调节系统中起关键作用，血管紧张素转化酶 抑制剂(ACEI)能通过抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性而达到抑制血压升高的作用。但 由于目前用于临床治疗的该类药物易产生不良反应和毒副作用，因此寻找高效和安全的ACEI 成为抗高血压药物研究方向之一。降血压肽(AHP)是一类能够降低人体血压的多肽的总称， 它是血管紧张素转化酶(ACE)的抑制剂，可通过抑制人体血管紧张素II的生成而达到降低血 压的目的。降血压肽毒副作用低、降压效果明显、来源广泛，已成为抗高血压药物研究的热 点之一。目前降血压肽的制备主要采用酶解法，但由于特异性蛋白酶筛选繁琐、分离纯化工 艺复杂、产量低等问题而无法实现产业化。利用基因工程技术生产降血压肽是克服上述困难 进行大规模生产的重要途径，有广阔应用前景。

公开号为CN101153310的发明专利申请公开一种复合酶解带鱼脊骨制备降血压肽的方 法，将带鱼脊骨粉碎后加水搅匀，调节pH，将温度升高到30～45℃，加入弹性蛋白酶，进 行酶解反应，然后将酶解液迅速升温至90～100℃，保持10～15min后，再迅速冷却至室温 终止反应，调酶解液pH为1.5～3.0，加入胃蛋白酶，进行酶解反应，而后反应体系迅速升温 至90～100℃，保持10～15min后，再迅速冷却至室温终止反应，离心后取上清液过滤、真 空浓缩、冷冻干燥，得到粉状降血压肽。

公开号为CN101168762的发明专利申请公开一种发酵法利用带鱼脊骨制备降血压肽的方 法，将蔗糖、粉碎后的带鱼脊骨、蛋白胨、K₂HPO₄、MgSO₄·7H₂O及水配制成发酵培养基， 灭菌后接种地衣芽孢杆菌，经培养得发酵液；发酵液离心后取上清液，将上清液过滤，滤液 灭酶；灭酶后的滤液离心，离心上清液用活性碳脱色除味，得脱色除味后的滤液；将脱色除 味后的滤液进行超滤，得透过液，透过液真空浓缩后冷冻干燥，得到具有降血压功能的肽粉。

公告号为CN1687444的发明专利提供一种利用酶-膜耦合技术制备紫菜降血压肽的方法 及用途。先对干紫菜进行包括粉碎、脱脂、溶解与超声作用的预处理，再对紫菜溶液采用蛋 白酶解与膜分离耦合的技术进行紫菜降血压肽的制备与分离，最后通过过滤、浓缩与干燥得 到粉状的紫菜降血压肽产品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产成本较低，便于进行规模化生产的降血压肽的制备方法。

本发明的技术方案是采用高密度发酵法，优化基因工程菌的培养基和培养条件，采用乳 糖诱导剂进行诱导，得到最佳发酵工艺条件。

本发明采用的大肠杆菌工程菌E.coli BL21/VLPVPR可购自GE公司(法玛西亚)，GE 公司的信息可参见网址：http://show.bioon.com/consumables/show_product.asp？id＝11364。

本发明包括以下步骤：

1)工作种子液的制备：配制固体平板培养基，将冻存的大肠杆菌工程菌E.coli BL21/VLPVP涂板后培养活化，再挑取单菌落接种入灭菌后种子培养基中，摇床培养得活化 菌种，即得工作种子液；

2)接种前准备：洗净发酵罐，用pH7.0和pH10.01标准液校正发酵罐的pH计探头，然 后将已配制好的经优化的培养基倒入发酵罐中，高压灭菌后冷却，高压过程中校正溶解氧DO 为0％；

3)接种，培养：灭菌结束待冷却到37℃后，在火焰圈的保护下加入消泡剂，以1％～6％ 的接种量将工作种子液接种于发酵罐中，培养温度为23～44℃，起始pH为6～7.5，校正相 对溶氧水平(DO)达100％；

4)补料：在发酵过程中，调节转速和通气量使DO维持在溶氧为10％～80％，培养1～ 4h后开始补料；

5)乳糖诱导表达VLPVPR重组蛋白阶段：停止补料后，开始乳糖诱导，诱导的条件为 诱导温度23～44℃，加入乳糖至终浓度0.1％～2％，诱导时间为5～8h；