[发明专利]应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及辣根过氧化物酶提取纯化的方法，尤其涉及一种应用单克隆抗 体亲和吸附技术从辣根中提取纯化辣根过氧化物酶的方法。

技术背景

过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP，EC 1.11.1.7)，通常来 源于辣根(Armoracia rusticana)(生长于欧洲和亚洲部分地区的多年生草本植 物)，因此称辣根过氧化物酶，该酶是临床检验试剂中的常用酶，不但用于 多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类实验检测等，过氧化物酶作为免疫 类显色体系的关键成分，对实验结果和相关产品质量的影响至关重要。

辣根过氧化物酶HRP比活性高，性质稳定，分子量小，所以被广泛地应 用于生命科学的各个领域。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由 无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由至少 15同功酶(A1-A3，B1-B3，C1，C2，D，E1-E6)组成，其中以辣根过氧化物酶 C(HRP C)含量最高；HRP分子量为40,000，等电点为PH3～9(酸性(A型)， 中性(B和C型)，碱性(D和E型))，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍 有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP 的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm/ OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值 应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。

早在80年前，HRP已经被纯化，并且被广泛应用在生物学各个领域；传统 的生产HRP的方法多是用硫酸铵和乙醇沉淀，这种方法不但产生大量废料污染 环境，酶的回收率低，纯度低，而且酶的活性在纯化过程也大大降低；在很多 情况下，HRP需要通过亲和吸附或者色谱分离技术进一步纯化，曾经有学者分别 用刀豆蛋白A(Con A)和苯氧肟酸(BHA)色谱技术纯化HRP，但是不能有效 避免蛋白质的非特异性结合问题(HRP是一种糖蛋白)，生产的HRP纯度不高。

发明内容

为了解决现有的HRP生产方法存在的回收率、纯度和酶活性低的技术缺陷， 本发明的目的是提供应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的方 法，该方法通过单克隆抗体亲和吸附技术提取纯化辣根过氧化物酶，具有节约 时间，节约成本，不污染环境，而且纯化的辣根过氧化物酶纯度高的特点。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的方法，该方法采用针 对辣根过氧化物酶具有高特异性和高亲和力的单克隆抗体与载体填料的藕联 物，通过亲和层析的方法从辣根中提取、纯化辣根过氧化物酶。

作为优选，上述的方法的步骤如下：

①采用上样缓冲液匀浆辣根，离心去除沉淀；

②将上清夜加入到单克隆抗体与载体填料的藕联物亲和填料，室温孵育10～ 60分钟；

③采用上样缓冲液洗掉非结合杂蛋白；

④采用酸性洗脱缓冲液解离被捕获的辣根过氧化物酶HRP，并迅速用中和缓 冲液中和，得到所述的辣根过氧化物酶HRP。

作为再优选，上述的上样缓冲液采用PBS 7.2；洗脱缓冲液采用0.05M甘氨 酸-盐酸缓冲液，PH2.7；中和缓冲液采用1M Tris-Cl，PH8.0。作为最优选，上 述的步骤④采用酸性洗脱缓冲液解离被捕获的辣根过氧化物酶HRP的温度为20 ℃。

作为优选，上述的载体填料采用琼脂糖凝胶4B、琼脂糖或免疫磁珠。作为 最优选，上述的载体填料采用琼脂糖凝胶4B。

本发明由于采用单克隆抗体亲和吸附纯化HRP，不但节约时间，节约成本， 而且不会产生很多废弃物，而且，与传统方法相比，酶的活性将大大提高，符 合环境友好型和社会节约型社会建设需求。经此技术提取纯化的HRP产品质优 价廉，将具有更强的市场竞争力，也符合技术发展对HRP越来越高的品质要求， 因此，本发明将取代传统的沉淀纯化方法。

具体实施方式

实施例1高特异性高亲和力单抗的筛选

从市场上购买针对HRP的特异性单抗，分别编号：01-13，按照以下步 骤筛选：

①高亲和力单抗筛选