[发明专利]应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的方法

权利要求书

1.应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的方法，其特征在于该方法包括以下 的步骤：

1)采用针对HRP的特异性单抗进行高亲和力单抗筛选和单抗对酶封闭活性测试：

通过比较不同的特异性单抗的OD450，选取相同实验条件下，OD450较高的单抗进行抗体 对酶封闭活性测试，抗体对酶封闭活性测试选取相同实验条件下OD450较高的单克隆抗 体；

2)辣根过氧化物酶具有高特异性和高亲和力的单克隆抗体获得后，采用该单克隆抗体与 载体填料的藕联物通过亲和层析的方法从辣根中提取纯化辣根过氧化物酶；具体步骤如 下：

①采用上样缓冲液匀浆辣根，离心去除沉淀，上样缓冲液采用PBS 7.2；

②将上清液加入到单克隆抗体与载体填料的藕联物亲和填料，室温孵育10～60分钟；

③采用上样缓冲液洗掉非结合杂蛋白；

④采用酸性洗脱缓冲液解离被捕获的辣根过氧化物酶HRP，洗脱缓冲液采用0.05M甘氨酸 -盐酸缓冲液，pH2.7，酸性洗脱缓冲液解离被捕获的辣根过氧化物酶HRP的温度为20 ℃；并迅速用中和缓冲液中和，中和缓冲液采用1M Tris-Cl，pH8.0，得到所述的辣 根过氧化物酶HRP。

2.根据权利要求1所述的应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的方法，其特 征在于：载体填料采用琼脂糖凝胶4B、琼脂糖或免疫磁珠。

3.根据权利要求2所述的应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的方法，其特 征在于：载体填料采用琼脂糖凝胶4B。

4.根据权利要求1所述的应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的方法，其特 征在于高亲和力单抗筛选方法如下：

①市场采购针对HRP的特异性单抗；

②用包被缓冲液50mM碳酸盐，pH 9.6，将特异性单抗按照不同浓度，100μL/孔， 包被于96孔酶标板中，4℃过夜；

③用PBS/Tween 20，洗板后，将HRP溶液分别加入包被特异性单抗孔和空白孔， 100μL/孔，37℃孵育30分钟；

④再次洗涤后，加入3，3’，5，5’-四甲基联苯胺TMB，室温反应10分钟，每孔加 100μL终止液2M H₂SO₄终止反应，通过酶标仪读取450nm吸光值OD₄₅₀；

⑤比较不同的特异性单抗的OD₄₅₀，选取相同实验条件下，OD₄₅₀较高的单抗进行抗体 对酶封闭活性测试。

5.根据权利要求1所述的应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的方法，其特 征在于单抗对酶封闭活性测试方法如下：

①用包被缓冲液50mM碳酸盐，pH 9.6，将特异性单抗按照不同浓度，100μL/孔， 包被于96孔酶标板中，4℃过夜；

②抗体对酶封闭活性测试也在96孔酶标板中进行，分别在包被特异性单抗和空白 酶标孔中滴加5μlHRP溶液；

③然后滴加100μl即用型TMB显色液II，室温反应10分钟，终止液2M H₂SO₄终 止反应，通过酶标仪读取450nm吸光值OD₄₅₀；

④选取相同实验条件下OD₄₅₀较高的单克隆抗体。