[发明专利]检测志贺氏菌的酶免疫传感器及其制备方法和运用

说明书

技术领域

本发明涉及食源性致病菌快速检测技术领域，特别是基于抗原抗体免疫反 应检测志贺氏菌的酶免疫传感器及其制备方法和运用。

背景技术

在全世界每年数以亿计的食源性疾病患者中，70％是由于食用了各种致病 性微生物污染的食品和饮水造成的。志贺氏菌(Shigella)是引起急性感染性腹泻 的主要病原体之一，少至10个细菌即可引起感染，感染人体会出现恶心、呕吐、 腹痛、腹泻(严重脓血便)等症状，甚至危及生命。每年有一百多万人因为感染志 贺氏菌而死亡，死者多为发展中国家的儿童。

志贺氏菌快速检测是进行大批量健康人群的体检和处理突发公共卫生事件 的最关键措施之一，对快速实施预防、治疗具有极为重大的意义。

目前，志贺氏菌常用检测方法包括国标法、酶联免疫吸附实验(ELISA)、PCR 及RT-PCR技术，基因芯片和核酸探针技术。国标法取材方便，但样品预处理复 杂、操作过程比较繁琐，检测周期较长，敏感度低；ELISA需要特殊的仪器设备， 检测步骤繁琐、费用高、检测时间长，并且易出现假阳性；PCR、基因芯片和核 酸探针技术所需仪器设备昂贵、检测过程复杂，对检测环境和操作人员专业技 术要求较高、所使用的试剂对人体和环境均有较大的危害，也易出现假阳性。 因此，建立一种灵敏、快速、简便、特异性高且经济的志贺氏菌检测方法是食 品生产经营企业、质控人员、进出口商检、政府管理部门的迫切需要和食品安 全的有力保障。

电化学分析可以实现现场检测，不受样品颜色、浊度的影响，样品可以不 经处理，无需分离，所用仪器设备相对简单，这些都使得电化学免疫传感成为 一种使用较为广泛的检测方法。近年来，在食源性致病菌检测领域中，免疫传 感器越来越引起人们的重视。它将电化学检测和传统免疫技术相结合的分析方 法，既有很好的特异性，又有较低的检测限。而且与其他技术相比，这种传感 器对仪器设备的要求低，操作简单，更大大地缩短了检测时间。采用丝网印刷 工艺制备的一次性使用电极更进一步降低了检测成本，在大规模地快速、准确 检测食源性致病菌中发挥着重要作用。

自从1991年Iijima发现多壁碳纳米管(multi-wall carbon nanotube)以来，多 壁碳纳米管因其优良的电学、力学性能以及潜在的应用前景而引起广泛关注。 多壁碳纳米管复合材料具有良好的导电性能和有利于保持生物分子活性，非常 适合于生物传感器的制备与应用。

发明内容

为了解决以上问题，本发明提供了一种灵敏、快速、准确、特异性高且经 济的检测志贺氏菌的酶免疫传感器，包括丝网印刷电极，所述丝网印刷电极的 工作电极上涂布有包埋“酶标记志贺氏菌抗体-碳纳米管-壳聚糖”混合物的敏感 膜。

优选地，所述的碳纳米管为多壁碳纳米管。

进一步地，所述的志贺氏菌为福氏志贺氏菌。

更进一步地，所述的酶标记志贺氏菌抗体为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、 乳酸脱氧酶、葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶、尿素水解酶标记的志贺氏菌抗体 中的一种或它们的混合物。

另一方面，本发明提供了上述酶免疫传感器的制备方法，其特征是包括以 下步骤：

1)将碳纳米管超声分散在壳聚糖溶胶中，得均一的碳纳米管-壳聚糖复合 物；

2)将酶标记志贺氏菌抗体与碳纳米管-壳聚糖复合物充分混合均匀，4℃ 放置12h，制得“酶标记志贺氏菌抗体-碳纳米管-壳聚糖”混合物；

3)将“酶标记志贺氏菌抗体-碳纳米管-壳聚糖”混合物涂布在丝网印刷电 极的工作电极表面，室温下干燥；

4)涂膜后的电极浸泡于含0.2％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液中，4℃ 下放置1h。

本发明还提供了一种使用上述酶免疫传感器检测志贺氏菌的方法，其特征 是包括以下步骤：

1)待测样本滴于酶免疫传感器的工作电极表面，28℃孵育30min；

2)免疫传感器置于电解池中，电解池的检测底液为含有0.6mmol/L H₂O₂和1.0mmol/L硫堇的醋酸盐缓冲液，pH值为7.0；

3)设定适宜的扫描参数，对工作电极施加电压，检测辅助电极与工作电 极间的电流值；

4)测定获得的电流信息输入数据采集与处理系统；

5)信息处理结果输出。