[发明专利]一种弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法

权利要求书

1.一种弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，其特征在于：该方法按以下步骤进行：

1)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：

(1)基本培养基：基本培养基采用MS培养基，其中，蔗糖或白糖20～30g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～6.0；

(2)无菌播种培养基：1/2MS；

(3)诱导培养基：1/3MS+BA 1.0～3.0mg/L和NAA 0.1～0.5mg/L；

(4)增殖培养基：1/2MS+BA 0.1～1.0mg/L和NAA 0.05～0.5mg/L；

(5)壮苗培养基：MS+BA0.1～0.5mg/L和NAA0.01～0.1mg/L；

(6)生根培养基：1/2MS+NAA 0.01～0.1mg/L；

2)、矮牵牛茎尖脱毒培养：

(1)外植体的选取与灭菌：取矮牵牛的种子，经灭菌处理后接种在无菌播种培养基上，在培养条件下培养30～45天后，从种子培养成高5～7cm的实生苗，无需灭菌直接作为茎尖脱毒培养用的外植体；或取温室盆栽的性状纯正、生长健壮的矮牵牛植株上的幼芽，经灭菌处理后作为茎尖脱毒培养用的外植体；

(2)茎尖脱毒培养：将无菌播种培养的实生苗的顶芽或灭菌处理后的温室盆栽的幼芽在无菌条件下，在40倍的双筒解剖镜下，摘出0.15～0.3mm大小的带1～2个叶原基的茎尖，接种在诱导培养基上，在培养条件下培养30～45天后，从茎尖诱导形成幼芽或丛生芽；

(3)增殖培养：将诱导形成的幼芽或丛生芽切成单芽接到增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天增殖出丛生芽；根据对幼苗数量的需求，每隔30～45天按同样方法进行幼苗再增殖培养；

(4)壮苗培养：将增殖出的丛生芽接种到壮苗培养基上，在培养条件下培养20～30天后，幼苗株高生长达2～5厘米；

(5)生根培养：将培养的壮苗切成单株接种在生根培养基中进行生根培养，在培养条件下培养20～30天后，幼苗长高成5～7cm、苗基部长出5～10根细根；

(6)移栽：在隔离温室中，将生根组培苗移栽于基质中，培育1～2个月至成苗；

(7)定植：在隔离温室中，将移栽苗定植在温室盆钵中，培育3～5个月至植株开花；

3)、病毒ELISA检测：

将常规温室中发生的矮牵牛病毒，经扩增、克隆和原核表达所获得的相关病毒外壳蛋白，注射小鼠或家兔免疫并制备成病毒特异性抗血清后，对移栽苗和开花植株进行病毒ELISA检测； 

4)、弱病毒的接种

将黄瓜花叶病毒的弱病毒株通过常规汁液摩擦方法接种到步骤3)检测为无病毒的矮牵牛植株上；弱病毒株为黄瓜花叶病毒的弱病毒株N14、黄瓜花叶病毒的卫星RNA生防制剂S52；

5)、弱病毒植株的组培繁殖：

(1)外植体的选取与灭菌：取步骤4)检测为弱病毒的矮牵牛植株上的幼芽，经灭菌处理后作为组培繁殖用的外植体；

(2)诱导培养：将灭菌处理后的幼芽接种在诱导培养基上，在培养条件下培养30～45天后，诱导形成丛生芽；

(3)增殖培养：将诱导形成的丛生芽切成单芽接到增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天增殖出丛生芽；根据对幼苗数量的需求，每隔30～45天按同样方法进行幼苗再增殖培养；

(4)壮苗培养：将增殖出的丛生芽接种到壮苗培养基上，在培养条件下培养20～30天后，幼苗株高生长达2～5厘米；

(5)生根培养：将培养的壮苗切成单株接种在生根培养基中进行生根培养，在培养条件下培养20～30天后，幼苗长高成约5～7cm、苗基部长出5～10根细根；

(6)移栽：将生根组培苗移栽于基质中，培育1～2个月至成苗；

(7)定植：将移栽苗定植在盆钵中，培育3～5个月至植株开花。

2.根据权利要求1所述的弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，其特征在于：所述的无菌播种培养时种子的灭菌处理是经75％酒精浸泡0.5～1.0分钟，再用0.1％升汞溶液灭菌20～30分钟，最后用无菌水冲洗3～5次。

3.根据权利要求1所述的弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，其特征在于：所述的温室盆栽植株幼芽的灭菌处理是经75％酒精浸泡0.5～1.0分钟，再用0.1％升汞溶液灭菌10～15分钟，最后用无菌水冲洗3～5次。