[发明专利]EV71型病毒抗原的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及手足口病主要致病病毒——肠道病毒71型病毒抗原的检测方法，属于 生物学技术领域。

背景技术

手足口病(Hand-foot-mouth disease，HFMD)主要是由肠道病毒71型(以下简称 EV71型)或柯萨奇病毒A16型(COX A16)感染导致的流行性疾病，感染临床表现多样 性，从隐性感染、普通手足口病和咽峡炎等轻症，到神经源性肺水肿和呼吸衰竭、中枢 神经系统感染等重症，且部分重症患者病情进展快，甚至死亡。手足口病在我国和世界 都有广泛流行，患者主要为学龄前儿童，尤以3岁以下儿童发病率高。与其他肠道病毒 引起的手足口病相比，由肠道病毒71型感染引起的疾病发生重症感染的比例较大，病 死率也较高。

在国外，20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利相继暴发以中枢神经系统感染为 主要特征的EV71流行，仅保加利亚就有超过750例病例，149人致瘫，44人死亡。20 世纪90年代后期，EV71开始在东亚地区传播。1997年马来西亚发生了主要由EV71引 起的手足口病流行，4-8月共发生2628例病例，仅4-6月就有29例病人死亡。死者平 均年龄1.5岁，病程仅2天。

2008年3-5月在安徽省阜阳市出现的EV-71感染暴发流行中，三个月内共出现了 69538人的感染，而死亡人数达到了39人。从而引起社会的恐慌。随后该疾病被纳入丙 类传染病管理。加强对EV71型感染病患的防控工作，已成为我国病毒性传染病管理工 作的目标之一。而相关疫苗的研究开发和病毒抗原的快速检测试剂盒是预防控制此传染 病的关键。

对EV71型的诊断，目前主要依赖病毒核酸检测和病毒分离培养，而目前基层医院 和疾病预防控制中心还没有条件开展，加上部分重症病例临床上并无典型的手足口病表 现，所以，在疫情暴发初期重症病例难以明确诊断，常被诊断为肺炎而延误最佳治疗时 间。只有结合病例的流行病学调查、临床表现，特别是实验室检测结果，才有可能进行 明确诊断。

发明内容

针对EV71型病毒抗原检测存在的上述现状，以及EV71型病毒研究过程中和相关疫 苗研制过程中需要对EV71型病毒抗原进行大量检测的需要，本发明利用生物素标记抗 EV71型病毒抗体，以辣根过氧化物酶标记链霉亲和素作放大系统，提供一种特异性高、 灵敏度高、使用方便、用途广泛的EV71型病毒抗原检测方法，以用于手足口病临床检 验诊断、EV71型病毒的鉴别检验、EV71型病毒疫苗的质量检验及质量控制，也可应用 于EV71型病毒的其他科研工作。

本发明通过下列技术方案完成：一种EV71型病毒抗原的检测方法，其特征在于经 过下列步骤：

A、按50～150μl/孔的量，将待检EV71型病毒抗原、抗原阳性对照和抗原阴性对照 分别加入酶标板的孔中，并留空白调零孔，放入湿盒中，于37℃保温0.5-2小时后，洗 板3～5次；

B、按50～150μl/孔的量，在A步骤的酶标板的各孔中，加入稀释度为1∶500～3000 的生物素标记EV71型抗体，放入湿盒中，于37℃保温0.5～2小时后洗板3～5次；

C、按50～150μl/孔的量，在B步骤的酶标板的各孔中，加入稀释度为1∶2000～10000 的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，放入湿盒中，于37℃保温0.5～2小时后洗板3～ 5次；

D、在C步骤的酶标板的各孔中，分别加入TMB显色液A和B各50μl/孔，混匀， 放入湿盒中，37℃保温10～15分钟；

E、在D步骤的酶标板的各孔中按50～100μl/孔的量加入终止液后置于酶标仪上， 在450nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，即得检测结果。

所述A步骤的酶标板预先经过下列方法处理：

1)酶标板包被：将纯化的EV71-IgG用碳酸盐缓冲液稀释至5-20μg/ml，按50～ 150μl/孔的量加入到聚苯乙烯板中，2～8℃过夜，洗板3～5次；

2)酶标板封闭：按100～250μl/孔的量加入封闭液，2～8℃过夜，对酶标板进行封 闭，洗板3～5次，晾干，冰箱保存备用。

所述1)的碳酸盐缓冲液、2)的封闭液为现有技术中的常规产品。

所述B步骤的生物素标记EV71型抗体经下列方法制备：