[发明专利]EV71型病毒抗原的检测方法

权利要求书

1.一种EV71型病毒疫苗生产检验中对EV71型病毒抗原进行检测的方法，其特征在于经过下列步骤： 

A、按50～150μl／孔的量，将待检EV71型病毒抗原、抗原阳性对照和抗原阴性对照分别加入酶标板的孔中，并留空白调零孔，放入湿盒中，于37℃保温0.5-2小时后，洗板3～5次； 

B、按50～150μl／孔的量，在A步骤的酶标板的各孔中，加入稀释度为1∶500～3000的生物素标记EV71型抗体，放入湿盒中，于37℃保温0.5～2小时后洗板3～5次； 

所述生物素标记EV71型抗体经下列方法制备： 

a)、按生物素∶EV71型病毒抗体=1∶5～20克分子比的比例，将生物素用注射用水溶解后，与EV71型病毒抗体混合，得混合体，于室温下放置0.5～1.0小时，或2～8℃温度下放置1～3小时； 

b)、用磷酸缓冲液于2～8℃温度下透析上述a)步骤的混合体并过夜，加等体积甘油混匀，得生物素标记EV71型抗体，-20℃以下保存备用； 

c)、将b)步骤的生物素标记EV71型抗体按1∶100、1∶200、1∶400......1∶5000的稀释度进行稀释，用常规棋盘法试验确定它们的最佳使用稀释度，得生物素标记EV71型抗体的稀释度为1∶500～3000； 

C、按50～150μl／孔的量，在B步骤的酶标板的各孔中，加入稀释度为1∶2000～10000的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，放入湿盒中，于37℃保温0.5～2小时后洗板3～5次； 

D、在C步骤的酶标板的各孔中，分别加入TMB显色液A和B各50μl／孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温10～15分钟； 

E、在D步骤的酶标板的各孔中按50～100μl／孔的量加入终止液后置于酶标仪上，在450nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，即得检测结果。 

2.如权利要求1所述的EV71型病毒疫苗生产检验中对EV71型病毒抗原进行检测的方法，其特征在于所述EV71型病毒抗体经过下列步骤分离纯化： 

1)取市购蛋白A／G亲和层析柱，室温放置平衡30分钟，用5倍柱体积的平衡液对层析柱进行平衡； 

2)将市购的抗EV71血清与常规平衡液按1∶1的体积比混合后上样，用10倍柱体积的平衡液洗脱杂蛋白，留下目的蛋白； 

3)用10倍柱体积的常规洗脱液将目的蛋白从亲和柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用常规磷酸缓冲液(PBS)透析过夜，得EV71型病毒抗体； 

4)用lowry法测定蛋白含量，贴签后置-20℃以下保存待用。 

3.如权利要求1所述的EV71型病毒疫苗生产检验中对EV71型病毒抗原进行检测的方法，其特征在于所述C步骤的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素为市购产品，将该产品按1∶100、1∶200、1∶400......1∶5000的稀释度进行稀释，用常规棋盘法试验确定它们的最佳使用稀释度，得辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素的稀释度为1∶2000～10000。