[发明专利]鉴别反刍动物源性成分的荧光PCR检测试剂及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种能同时鉴别三种反刍动物品种的生物检测试剂，以及这种试剂的制备方法和应用。

背景技术

为了防御疯牛病和痒病经饲料传播，检疫部门一直对进出口饲料以及来自疯牛病、痒病疫区的动物产品、化妆品等进行牛羊源性成分检测，这也是动物源性成分检测最初开展的项目和目的。如今，随着国际贸易的飞速发展，防御国际间动物疫病传播的难度也在加大，不同动物源性产品的掺假混杂可能导致潜在动物疫病的加速传播，更有一些日常生活用品存在不同动物源性的限定性、优选性和价格差异等问题，如清真食品中不可含有猪源性成分，南方地区的羊奶比牛奶价格贵2倍以上，肉丸、肉肠中肉品的掺假，以及以一般动物题材冒充珍稀动物来源的中药或皮张等。由此而引发了对各种动物源性成分检测方法的大量探索和开发，动物源性成分的鉴定逐渐成为动物疫病的防御、商品贸易的品质管理和野生动物的保护等多个执法领域中必需的检测技术。

当前，国内己发布了牛、羊(不区分山羊和绵羊)、鹿、骆驼、马、驴、猪、兔、狗、鱼、哺乳动物、反刍动物(包括牛、羊和鹿)等多种动物源性成分检测的国家标准或行业标准，而鸡、鸭、蛇、猫等多种动物源性成分的检测方法也已经有研究论文报道，更多品种的动物源性成分检测方法还在陆续研究开发当中。由于应用领域丰富，与百姓生活息息相关，动物源性成分检测不仅是执法管理部门必须掌握的技术手段，也是企业生产质量控制的关键检测技术，如今，动物源性成分的检测已经成为一个热门研究领域。

据文献报道，目前动物源性成分检测方法主要有物理外观检查、蛋白电泳、色谱分析、近红外光谱分析、ELISA免疫杂交筛选、一般PCR方法和荧光PCR方法等。这些方法在检测素材、检测效率、特异性、灵敏度和应用层面等方面都存在差异，需要根据具体的检测目的、检测成本和现有的仪器设备等多个因素选择合适的检测方法。其中，牛羊源性成分的检测在检验检疫系统内应用得比较广泛，主要检测目的是要有效防御疯牛病和羊痒病经饲料途径传入我国。国家质检总局与农业部联合发布了相关公告，禁止从疯牛病发生国家或地区进口反刍动物源性饲料等动物产品，对允许进口的其他非反刍动物源性饲料，必须进行牛羊源性成分检测。目前，检疫部门依据国家标准《饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应(PCR)法》(GB/T 20190-2006)对进出口饲料进行牛羊源性成分检测。这是一般PCR方法，需对PCR产物进行凝胶电泳才能完成整个检测。一旦遇到可疑阳性结果，必须进行酶切鉴定，若要鉴定是山羊还是绵羊源性成分，还必须进行DNA测序。

而在日常生活用品中经常有牛、山羊或绵羊源性的优选性或价格差异等问题存在。例如，一般来说，羊肉比牛肉贵，羊奶比牛奶贵，而源自山羊或绵羊的肉品、奶品、皮张和毛绒纤维均有价格差异。随着改革开放的不断深入，我国牛羊产品的生产和流通已全部放开，在经济利益的驱使下，一些不法分子为牟取暴利，大肆掺杂使假，损害牛羊产品质量，破坏我国牛羊产品资源，也可能对我国出口的牛羊产品在国际市场上的声誉造成损害。要杜绝这些掺杂使假的现象，关键手段是要建立一种能快速准确鉴别牛、山羊和绵羊源性成分的检测方法，为上述产品的质量做本质上的把关，提高执法的科学性和高效性，进一步提高检验检疫通关速度。另一方面，很多饲料在加工过程中经过多次高温烘焙，当中的DNA要受到影响而降解为许多小片段，如果检测目的片段太大，可能在检测中无法发现阳性片段。而受电泳检测有效性的限制，一般PCR难以采纳小片段目的产物。

因此，基于时效性和准确性上的优势，实时荧光PCR技术已经在动物源性成分检测的很多项目上逐步取代了一般PCR方法，成为检测动物源性成分最常用的分子生物学方法。但是到目前为止，我国尚未有同时鉴别检测牛、山羊和绵羊源性成分的三重TaqMan实时荧光PCR快速检测方法研究和相关检测试剂的报道。

中国专利申请号200580003457.7公开了一种“通过PCR检测反刍动物DNA”的方法，该申请为扩增样品中反刍动物DNA的方法，所述方法包括：使来自所述样品的核酸与RNA酶接触，从而生成RNA酶处理的核酸；和用第一反刍动物特异性引物和第二反刍动物特异性引物扩增所述RNA酶处理的核酸，从而扩增所述样品中存在的反刍动物DNA并生成扩增的反刍动物DNA。