[发明专利]鉴别反刍动物源性成分的荧光PCR检测试剂及制备方法和应用

权利要求书

1、一种鉴别反刍动物源性成分的荧光PCR检测试剂，其特征在于包含两对特异性引物和三条TaqMan探针，其中，一对引物针对牛源性成分，另一对是针对山羊和绵羊源性成分检测的通用引物，三条探针分别针对牛、山羊和绵羊源性成分，对牛、山羊和绵羊源性成分检测的扩增目标片段长度分别为92bp、136bp和136bp，引物和探针序列如下：

A、牛源性成分检测引物和探针序列：

引物：B-F：5’-TGGAGTAATCCTTCTGCTCACAGT-3’

B-R：5’-TGACTGTTGCTCCTCAGAATGATA-3’

探针：B-probe：FAM-5’-AGCATTTATAGGATACGTCC-3’-MGB

B、山羊源性成分检测引物和探针序列：

引物：G-O-F：5’-AGAAACATGAAACATC(T)GGA-3’

G-O-R：5’-ATATGGAATTGCTGAAAGAA(G)-3’

探针：G-probe：ROX-5’-TCCTGCTCGCAACAATGGC-3’-MGB

C、绵羊源性成分检测引物和探针序列：

引物：G-O-F：5’-AGAAACATGAAACATC(T)GGA-3’

G-O-R：5’-ATATGGAATTGCTGAAAGAA(G)-3’

探针：O-probe：HEX-5’-TCCTATTTGCGACAATAGC-3’-TAMRA。

2、如权利要求1所述的鉴别反刍动物源性成分的荧光PCR检测试剂的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：

一、分别选择牛、山羊和绵羊线粒体基因中特异和保守的cyt b基因的保守序列片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列分别为：

(1)牛源性成分的检测扩增目标序列：

TGGAGTAATCCTTCTGCTCACAGTAATAGCCACAGCATTTATAGGATACGTCCTGCCATGAGGACAAATATCATTCTGAGGAGCAACAGTCA；

(2)山羊源性成分的检测扩增目标序列：

AGAAACATGAAACATCGGAGTAATCCTCCTGCTCGCAACAATGGCCACAGCATTCATAGGCTATGTTTTACCATGAGGACAAATATCATTTTGAGGGGCAACAGTCATCACTAATCTTCTTTCAGCAATTCCATAT；

(3)绵羊源性成分的检测扩增目标序列：

AGAAACATGAAACATCGGAGTAATCCTCCTATTTGCGACAATAGCCACAGCATTCATAGGCTATGTTTTACCATGAGGACAAATATCATTCTGAGGAGCAACAGTTATTACCAACCTTCTTTCAGCAATTCCATAT；

二、根据牛、山羊和绵羊特异和保守的线粒体基因保守序列的特点，应用Primer Express3.0软件和DNAStar中的PrimerSelect软件，设计合成多组待测引物和探针；

三、引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；

四、探针合成同时进行两端标记，检测牛源性成分的探针5’端标记的荧光报告基团是FAM(6-羧基荧光素)，3’端标记的基团是MGB(DNA小沟结合物)；检测山羊源性成分的探针5’端标记的荧光报告基团是ROX(6-羧基诺丹明)，3’端标记的基团是MGB(DNA小沟结合物)；检测绵羊源性成分的探针5’端标记的荧光报告基团是HEX(六氯-6-甲基荧光素)，3’端标记的荧光淬灭基团是TAMRA(6-羧基四甲基诺丹明)；

五、将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，得到权利要求1所述的引物和探针。

3、权利要求1所述的鉴别反刍动物源性成分的荧光PCR检测试剂在制备一种能同时鉴别检测牛、山羊和绵羊三种反刍动物源性成分的荧光PCR标准化试剂盒中的应用。