[发明专利]动物虫媒病多重RT-PCR鉴别检测试剂及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域。尤其是一种能够同时鉴别检测四种动物虫媒病的试剂，以及这 种试剂的制备方法和应用。

背景技术

蓝舌病(Bluetongue disease，BLU)是由呼肠孤病毒科(reoviridae)环状病毒属(Obivirus genus)的蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的一种烈性动物传染病，由库蠓传播，主要 危害绵羊、山羊、牛等家畜，并在世界范围内广泛流行，世界动物卫生组织(World organisation for animal health，OIE)将BLU列为重要动物传染病。在很多国家动物贸易协定中，BLU是必 须进行检疫的传染病之一。近年来，随着气候变暖，BLU在欧洲许多国家的发病率增加，严重 影响着国际动物贸易。BTV共有24个血清型，BTV基因组含有10个双链RNA片段(dsRNA)， 由19218bp组成，编码7种结构蛋白(VP1-VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3和NS3A)， 7种结构蛋白的4种形成双层蛋白衣壳，外壳主要由VP2和VP5构成，而内壳主要由VP3和 VP7构成。VP7是核芯衣壳表面壳粒的主要成分，约占病毒总蛋白的1/3，是病毒可溶性群 特异性抗原。VP7基因也是BTV群特异性分子检测的靶基因。

鹿流行性出血病(epizootic haemorrhagic disease of deer，EHD)是一种季节性、非接触性的 病毒性传染病。鹿流行性出血病病毒(EHDV)也是呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属 (Orbivirus)的成员，是通过节肢动物(主要是库蠓)传播的双股RNA病毒。在自然条件下，鹿 流行性出血病病毒可引起牛、绵羊等家畜及白尾鹿、糜、大角羚羊等多种驯养和野生反刍动物 感染。临床特征为体温短暂升高，呈休克症状，粘膜和浆膜出血，于昏迷状态下死亡。病变呈 广泛性充血、出血、严重水肿和血管坏死，有时出现腹膜水肿。目前EHD共发现8个血清型， 分别是EHDV-1、EHDV-2、EHDV-3、EHDV-4，EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8等。 EHDV在形态结构上与蓝舌病病毒极为相似，血清学上与蓝舌病有明显交叉，其VP7蛋白是病 毒可溶性群特异性抗原，VP7基因也是EHDV群特异性分子检测的靶基因。本病目前尚无有效 疫苗和治疗措施，控制和消灭EHD必须花费大量的人力物力，出口贸易也因此受限，给EHDV 流行的国家带来很大的经济损失。EHDV的快速检测方法和试剂是动物检疫中急需解决的关键 技术问题。

水泡性口炎(Vesicular stomatitis，VS)是由水泡性口炎病毒(VSV)引起的牛、猪、马、鹿 等多种动物和人感染的一种病毒性人畜共患病。VSV属于弹状病毒科水泡病毒属的病毒。分为 两个血清型：新泽西型(VSV-NJ)和印第安那型(VSV-IND)。它是牛、猪、马的流行性和散 发性疾病，还可感染其它许多哺乳动物。人对此病毒易感，可产生类似流感样症状和口腔、手 足的水泡。牛、猪、马感染后引起严重的口腔粘膜、乳头皮肤及蹄冠皮肤出现水泡及糜烂，造 成巨大的经济损失。临床症状与口蹄疫(FMD)、水泡病(SVD)和水泡疹(VE)很相似，不 易区别。

赤羽病是由赤羽病病毒(Akabane virus，AKV)引起的牛、羊等动物流产、死产、死胎、胎儿 畸形、以及先天性关节弯曲一积水性无脑综合征的一种动物虫媒传染病。1990年时证实该病在 我国存在。赤羽病病毒属于布尼病毒科(Bunyaviridae)布尼病毒属辛布(simbu)病毒血清群的一个 亚群，为单股负链RNA病毒。目前，赤羽病的诊断主要通过病毒分离、琼脂免疫扩散试验(AGID)、 中和试验和ELISA试验等方法。AKA给畜牧业造成了严重的经济损失，是我国动物疾病防制 和国际动物贸易中的重点检疫对象。因此有必要加强对该病的研究与检测监控，防止该病在我 国的发生、传播和大规模流行。