[发明专利]鹿流行性出血热病毒单克隆抗体及制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种鹿流行性出血热病毒单克隆抗体，制备方法及其用途。

背景技术

鹿流行性出血病(epizootic haemorrhagic disease of deer，EHD)是一种季节性、非接触性的病毒性传染病。鹿流行性出血病病毒(EHDV)为呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)的成员，是通过节肢动物(主要是库蠓)传播的双股RNA病毒，在形态结构上与蓝舌病病毒(BTV)极为相似，血清学上与蓝舌病有明显交叉。在自然条件下，鹿流行性出血病病毒可引起牛、绵羊等家畜及白尾鹿(Odocoileus virginianus)、糜、大角羚羊等多种驯养和野生反刍动物感染。美国已从白尾鹿、黑尾鹿、绵羊、山羊、牛、野牛及库蠓体内分离到了病毒。以白尾鹿最为严重，临床特征为体温短暂升高，呈休克症状，粘膜和浆膜出血，于昏迷状态下死亡。病变呈广泛性充血、出血、严重水肿和血管坏死，有时出现腹膜水肿。绵羊EHD与蓝舌病(bluetongue virus，BTV)相似，死亡率2～30％，牛感染后可以检测到抗体，但不表现症状，美国牛群中EHD病毒的血清阳性相当普遍。该病在日本、中国台湾、朝鲜都有报道，临床以发热、精神沉郁、吞咽困难、消瘦等为特征，有时还导致怀孕牛流产、死产。

目前EHD共发现8个血清型，美国大多为EHDV-2、EHDV-1，澳大利亚有EHDV-1、EHDV-2、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8等6个血清型。尼日利亚^]分离到EHDV-3、EHDV-4。另外，印度尼西亚、中国台湾省、马来西亚、菲律宾、圭亚等地都分离到EHDV。本病目前尚无有效疫苗和治疗措施，控制和消灭EHD必须花费大量的人力物力，出口贸易也因此受限，给EHDV流行的国家带来很大的经济损失。建立基于单克隆抗体的鹿流行性出血病竞争酶联免疫吸附试验(c-ELISA)方法，是动物检疫中急需解决的关键技术问题。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种鹿流行性出血热病毒单克隆抗体。

本发明的另一目的是提供这种单克隆抗体的制备方法。

本发明的再一目的是提供这种单克隆抗体的用途。

本发明所述的鹿流行性出血热病毒单克隆抗体是一种免疫球蛋白-IgG，由重链和轻链构成，是由经过鹿流行性出血热病毒免疫BALB/c小鼠的脾淋巴细胞分化形成的B细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)通过细胞融合后获得的杂交瘤细胞分泌产生的、只针对鹿流行性出血病病毒特异性抗原决定簇的抗体。

本发明所述的鹿流行性出血热病毒单克隆抗体是采用杂交瘤细胞技术，用纯化的EHDV免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合，用HAT选择性培养基进行培养后，分别用纯化的EHDV抗原和正常仓鼠肾传代细胞(BHK21)对照抗原包被的间接ELISA进行筛选，经有限稀释法筛选克隆，获得能稳定传代并分泌抗特异性EHDV的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株，并制备EHDV的McAb小鼠腹水，制备而成的抗EHDV的单克隆抗体。

本发明所涉及的鹿流行性出血热病毒单克隆抗体的制备方法是利用细胞工程、抗体工程和免疫学技术，获得分泌抗EHDV的单克隆抗体的细胞株，通过同品系的小鼠诱导腹水，制备抗EHDV的单克隆抗体。

由以下步骤组成：

一、鹿流行性出血热病毒的纯化；EHDV接种BHK-21细胞，出现细胞病变后收获病毒，反复冻融3次，二次离心将细胞碎片和病毒液分开，采用20％、60％(w/v)不连续蔗糖密度梯度超速离心3h，以纯化EHDV病毒；

二、用提纯的鹿流行性出血热病毒抗原免疫BALB/c鼠；每隔2周免疫1次，共免疫3次，纯化的EHDV病毒注射剂量分别100μg、100μg和200μg；

三、取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇(MW4000)融合剂下融合，HAT筛选培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法检测分泌抗EHDV的阳性孔；

四、用有限稀释法进行细胞克隆，经间接ELISA筛选阳性克隆，获得能稳定传代并分泌抗EHDV的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞；

五、挑选12周龄BALB/C小鼠，按5～10×10⁵个杂交瘤细胞注射入BALB/c鼠腹腔制备单克隆抗体腹水；

六、用间接ELISA所述的方法鉴定制备单克隆抗体仅与EHDV有特异性免疫反应，而与其它相关病毒没有任何免疫反应。