[发明专利]一种烟草青枯病抗性的苗期鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于作物抗病性鉴定技术领域，具体涉及一种烟草青枯病抗性的苗期鉴定方法。

背景技术：

烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum，简称青枯菌)引起的一种主要从根部侵入的土传病害，在我国南方烟区普遍发生，对烟草生产具有很大威胁。选育与种植抗病品种是控制青枯病发生与流行的经济有效防治措施。但在抗病育种相关研究中，需要准确快速评价大量材料的抗性表现。现有的烟草青枯病抗性鉴定方法主要有以下两种：1)大田病圃人工接种方法。该方法可以较好地反应品种的抗性。但是该方法存在以下缺点：鉴定周期长，每年只能鉴定一次；所需病圃面积大，用于鉴定的烟草材料数量少；青枯菌菌悬液需要数量大；发病不均匀。而且还存在供试材料的抗性表现年份间和地点间差异较大等问题。2)苗期盆栽人工接种方法。该方法有利于解决病圃面积不够的问题。青枯病苗期接种方法主要有伤根灌注法、浸根法、毛细管刺茎渗透法、剪叶接种法及离体水培法等。其中伤根灌注法接种能引起严重的侵染，接种效果相对稳定，与病区自然发病鉴定结果之间的相关性高，剪叶接种法和离体水培法与病害自然侵染过程的差异大，毛细管刺茎渗透法和剪叶接种法的接种效果不稳定，且与品种在病区的抗性表现的相关性偏低。伤根灌注法接种实验中，土壤温度和接种菌浓度显著影响烟苗的发病程度。苗期土壤盆栽抗性鉴定，在无控温设备的塑料拱棚温室中，当实验期间气温偏低时，经常出现发病缓慢、发病不严重等问题。苗期水培抗性鉴定在茄子、番茄抗青枯病研究中得到成功应用，在中国发明专利“鉴定植物抗青枯病能力的水培接菌法”，(专利号ZL00117404.5)中有介绍。我国烟草行业普遍采用漂浮育苗，因此，在漂浮育苗基础上，建立烟草青枯病抗性的漂浮池水培接种鉴定方法，对抗病种质资源筛选、抗性遗传特性研究和抗病育种具有重要意义。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种烟草青枯病抗性的苗期鉴定方法，以弥补现有技术的不足。该方法用漂浮池恒温水培接种鉴定结果代替传统的土壤盆栽和大田鉴定结果，消除环境温度和湿度对鉴定结果的影响，避免其他病害对鉴定结果的干扰。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

1)建造保温循环漂浮池

在玻璃温室或塑料大棚温室内建造，在常规漂浮池的池底垫一层厚约4cm的泡沫塑料板，铺2层塑料膜，整个池壁四周用泡沫塑料板保温。苗池一端设控温电加热棒(中山超信电器厂产品)和池水循环泵(广东海利集团有限公司产品)。控温电加热棒和池水循环泵构成的加加控温设备通过控温装置联动。池水采用深井水或自来水。水深5cm～20cm。根据青枯病适宜发病温度和云南病区土温设置水温为25.0℃～28.0℃。

2)烟苗移植及日常管理

烟苗两次剪叶后，株高9cm～11cm，苗龄45d～55d，每个待鉴定材料挑选15～200株，移植到新的漂浮盘中。以NC95品种为抗病对照，以Hicks品种为感病对照。漂浮池营养液的氮素浓度控制在100mg/kg～250mg/kg。为排除黑胫病的影响，在水中施入58％甲霜灵锰锌。根据池水蒸发量，经常补充池水至初始水深。采用自动温湿度记录仪(杭州哈泰克公司产品)每小时记录一次水温。

3)接种体制备及接种

将保存的青枯菌菌株使用前在TTC培养基上活化48h，挑典型单菌落至TTC平板培养基上，28℃培养48h。将菌苔刮下，接种到1/10 BG培养液，28℃震荡培养36h至48h。培养液于5000×g离心15min收集菌体，用井水或过夜自来水配成菌悬液。接种时在漂浮池中加入青枯菌悬液，根据菌悬液OD₆₀₀值，调整池水中菌浓度至1×10⁷cfu/mL～1×10⁸cfu/mL。

4)病情调查与分级

接种后10d调查发病情况，以后每隔2～3d调查一次发病情况。记录发病率及病情指数。以感病对照发病率达到80％左右的病情指数作为品种抗性评价标准。