[发明专利]一种乙型肝炎病毒多位点基因耐药突变检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种乙型肝炎病毒多位点基因耐药突变检测方法，特别是涉及采用单管巢 式聚合酶链反应(PCR)扩增方法用于检测乙型肝炎病毒(HBV)逆转录酶全基因序列。

背景技术：

核苷(酸)类药物是乙肝抗病毒治疗的主要药物，目前临床应用的抗HBV核苷(酸) 类药物的靶位均为HBV逆转录酶(reverse transcriptase，RT)，长期应用会产生RT基因耐 药突变问题，若在用药前检测耐药突变，可以指导临床合理用药，避免原发耐药突变的影 响；如果在基因水平耐药或病毒突破早期检出耐药，及早进行临床干预，可避免病情反弹； 即使出现生化突破，检测耐药突变对确定病情变化的原因也十分有意义。总之，耐药突变 的检测对提高抗病毒疗效具有至关重要意义。

目前国际公认的用于临床检测病毒基因耐药的方法有PCR产物直接测序法和反向线 性杂交法等。其中：

PCR产物直接测序法的优点是提供的信息量丰富，可以检测已知与未知的突变，缺点 是检测灵敏度较低，常规PCR方法需要血清病毒载量≥10⁵拷贝/mL(5拷贝约相当于1IU)。 这样的灵敏度无法满足临床检测的需求，因为基因水平耐药期或病毒突破早期的HBV DNA通常属于低病毒载量(＜10⁵拷贝/mL，图1)。

反向线性杂交法的优点是检测灵敏度较高，可检测到≥5％的突变株，但只能检测已知 突变，且目前技术上对同一突变位点(如rt184位点)中的多种突变形式分辩力有限，此 外，使用反向线性杂交法的试剂和配套仪器成本较高，难以在临床推广。【Lok AS，et al. Hepatology，2007，46(1)：254-265.Degertekin B，et al.J Hepatol，2009，50(1)：42-48.】。

用巢式PCR技术可在一定程度上提高直接测序法的检测灵敏度。传统巢式PCR利用 两套PCR引物进行两轮PCR扩增反应，使用两对引物进行两轮扩增反应，一般先经过15-30 个循环的标准扩增，再个体化对小部分第1轮扩增产物稀释100-1000倍，再加到第二轮 扩增中进行15-30个循环，或者通过凝胶纯化将起始扩增产物进行大小选择。传统巢式PCR 两轮反应分别在二管中进行产生了以下缺点：一是增加了PCR扩增产物的污染机会；二 是不适宜对病毒载量差异较大的样本进行同时检测；三是增加了检测的成本。

有文献报道单管巢式PCR技术用于检测病毒，但扩增的基因片段一般较短(100-500 bp)。如杨建荣等(实用医学杂志2007；23(2)：195-)报道了单管巢式PCR结合熔解曲线 分析检测乙肝病毒YMDD突变。此文强调的是实时荧光定量检测，实时观察在PCR反应 进程中溶解曲线的变化，随时终止反应。因为只检测YMDD(即rtM204V/I)单一位点突 变，所以需要扩增的片段很短(仅有160bp)即可满足。但该方法不涉及扩增较长的基因 片段。又如姚李四等(中华检验医学杂志，2005，28(4)：447.)报道了单管巢式聚合酶链反 应用于禽流感病毒核酸检测。此文强调专门针对禽流感病毒核酸鉴定的一种检测方法，禽 流感病毒为RNA病毒，先进行一步法RT-PCR获得第一轮PCR产物，然后将第二轮反应 液全部加入第一轮产物中，实现禽流感病毒的特异性扩增。扩增产物也仅为273bp。

上述单管巢式PCR技术的文献方法没有解决以下几个问题：

1、较长基因片段的扩增效率；

在扩增全长1200bp HBV逆转录酶基因时，扩增难度大大增加，对灵敏度要求也增加 了；

2、终点产物检测；

终点产物检测(非实时观察溶解曲线)对技术要求更高，尤其是需要一次性同时扩增 初始模板量差异9个数量级的多个样本时，要求终点产物要均一，所以对扩增的线性范围 要求也增加了，此外其PCR扩增特异性是也需要解决的关键；

3、分析HBV逆转录酶全基因中包括YMDD突变在内的所有已知和未知突变位点。

随着抗HBV核苷(酸)类药物种类的增多，HBV耐药突变的位点数量和突变形式也 在增加，临床检测YMDD突变常用的实时荧光PCR法难以同时进行多位点基因突变检测。