[发明专利]基于免疫毛细管电泳-激光诱导荧光的基因组DNA整体甲基化水平分析

说明书

技术领域

本发明涉及生物学检测技术领域，具体是一种基于免疫毛细管电泳-激光诱导荧光技术的DNA整体甲基化水平高效、快速检测方法。

背景技术

DNA甲基化是脊椎动物最重要的表观遗传修饰形式之一，对于哺乳动物胚胎的正常发育具有重要作用，与基因表达调控、雌性个体X染色体的失活、遗传印迹等密切相关。异常DNA甲基化可以对基因组产生负面的影响，与人类许多疾病相关，是癌症的重要标识。其中，基因组整体低甲基化状态作为异常的DNA甲基化形式之一，在多种癌细胞中均可检测到，可以影响染色体结构、增加染色体重组和突变的频率以及使原癌基因激活等，是癌症发生的一个重要机制。

近年来随着DNA甲基化检测技术的快速发展，DNA甲基化与人类疾病的研究不断深入。对基因组DNA整体甲基化水平的检测可以实现对癌症等疾病的诊断，研究各种环境污染物的致癌机理等。近来DNA整体甲基化分析主要依靠高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)等检测手段，将基因组DNA酶解为单个核苷或碱基，检测甲基化胞嘧啶占总胞嘧啶的比例，以此分析基因组DNA的整体甲基化水平。在这些检测方法中毛细管电泳-激光诱导荧光(CE-LIF)具有灵敏度高，DNA用量少等优点，但样品制备过程中DNA酶解操作繁琐，且需要对核苷进行化学修饰，限制了其对大规模以及特殊样品的分析。

本发明将毛细管电泳-激光诱导荧光技术的快速、高灵敏度等优势与免疫学方法的特异性、准确性相结合，克服了传统检测方法的缺陷，实现对DNA整体甲基化水平的高效、快速检测，适用于环境污染物对DNA甲基化影响的快速筛选及癌症等疾病的表观遗传学评估。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用免疫毛细管电泳-激光诱导荧光技术(immuno-CE-LIF)进行DNA整体甲基化水平的检测方法。

本发明提供的DNA整体甲基化水平检测原理如图1所示，其具体检测方法依次包括以下步骤：

1)待检测DNA与抗体结合反应；

2)免疫毛细管电泳-激光诱导荧光技术分离检测DNA-抗体免疫复合物；

3)对DNA-抗体免疫复合物进行定量分析，确定待测DNA中整体甲基化水平。

步骤1)所述抗体可以特异性识别甲基化胞嘧啶并与之结合，荧光染料可以标记于一抗，也可以使用可与一抗结合的荧光标记二抗。

利用免疫毛细管电泳-激光诱导荧光技术进行DNA整体甲基化水平的检测方法为：DNA与抗体反应混合物进入毛细管，在电泳运行缓冲液中得以分离；荧光标记经过毛细管检测窗口被激发光激发，产生的荧光信号由PMT检测，经过信号转换在色谱工作站中处理为毛细管电泳谱图。若待检测DNA中没有甲基化胞嘧啶，则只能检测到荧光标记的抗体(或抗体复合物)信号，在毛细管电泳谱图中只有抗体峰产生；若待检测DNA中含有甲基化胞嘧啶，则能够检测到抗体(或抗体复合物)信号以及DNA-抗体免疫复合物信号，在电泳谱图中分别显示抗体峰和DNA-抗体免疫复合物峰。

在色谱工作站中进行数据处理，对DNA-抗体免疫复合物峰面积进行积分，根据积分所得峰面积确定待测DNA的整体甲基化水平。

本发明所提供的DNA整体甲基化水平的检测方法，具有DNA用量少，检测灵敏度高，高效快速等优点，克服了传统检测方法DNA操作繁琐，检测时间长等缺陷，具有广泛的应用前景。本发明可以应用于各种细胞、组织DNA的整体甲基化水平检测，天然产物、合成药物、中草药中有效成分的筛选，环境污染物对生物体DNA整体甲基化水平影响的快速筛选以及癌症等人类疾病的表观遗传学评估。

附图说明

图1为immuno-CE-LIF技术检测DNA整体甲基化水平原理图；

图2为对mλDNA中整体甲基化水平检测的immuno-CE-LIF电泳图；

图3为不同浓度λDNA和mλDNA的immuno-CE-LIF检测结果；

图4为总λDNA中mλDNA比例不同时的immuno-CE-LIF检测结果；

图5为A549细胞基因组DNA整体甲基化水平immuno-CE-LIF电泳图；

图6为不同浓度A549细胞基因组DNA的检测结果；

图7为A549细胞和HepG2细胞经不同浓度5-Aza-dC暴露后基因组DNA整体甲基化水平检测结果。

具体实施方式

本发明的具体实施方法包括以下几个步骤：

1、DNA与抗体反应