[发明专利]禽流感合成肽疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于禽流感合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及 含有该多肽或其多肽聚合物的疫苗及它们的制备方法。

背景技术

禽流感(Avian influenza，AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus， AIV)引起的多种禽类感染的传染病，被国际兽医局(OIE)列为A类传染病， 也被我国列为一类动物疾病。AIV是属于正粘病毒科流感病毒属的A型流感 病毒，其基因组是由8个分节段的单股负链RNA组成，分别编码8种不同功能 的蛋白：多聚酶蛋白PB1、PB2、PA；血凝素蛋白HA；核衣壳蛋白NP；神 经氨酸酶蛋白NA；基质蛋白M1和M2，以及非结构蛋白NS1和NS2，其中， 血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和M2蛋白为禽流感病毒的三种表面抗原 分子，针对这三种抗原的抗体都有抑制流感病毒感染的作用。

禽流感灭活疫苗的保护效力具有亚型特异性，而禽对已知的15种HA亚 型都易感，且人们无法预测什么时候家禽会感染哪种亚型，一次使用预防性 疫苗来阻止所有可能的亚型禽流感的发生是不现实的。此外，HA和NA抗原 性变异频率很高，不同变异株不产生交叉保护，研制此类抗原疫苗的速度往 往跟不上病毒变异，这就是目前我国虽不断使用疫苗，但禽流感却不断爆发 的原因所在。

为此，禽病科学家一直致力于研究其他类型的疫苗，如DNA疫苗，现已 诞生了由杆状病毒表达的禽流感病毒H5N1的HA基因制成的亚单位疫苗；表 达HA或NA基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗。这些疫苗的一个突出优点就是 只使用了禽流感病毒的某一种或某二种抗原成分，这样有利于开发针对性地 检测方法对疫情进行监测。但是，这些疫苗同样无法提供抵抗各种亚型的禽 流感的交叉保护作用。因此，开发新型的广泛性防治禽流感病毒感染的技术 成为科学工作者的研究热点。

利用A型禽流感病毒M2蛋白是研究具有交叉保护性疫苗的一个重要方 向，相关研究如下：Watanabe T等利用缺失M2跨膜区的流感病毒制成了活疫 苗；Slepushkin VA等和Frace，M.等的研究表明基因工程表达的M2免疫之后， 能够保护小鼠抵御不同亚型流感病毒的攻击；Neirynck(1999)等将A型流 感病毒的保守的M2蛋白胞外区与乙肝病毒核心蛋白融合，试图产生一个针 对流感病毒的通用疫苗，他们发现对小鼠进行腹腔注射或鼻内施用，可使 99-100％的小鼠产生对致病性流感病毒X47攻击免疫力；Mozdzanowska K等 (2003)将M2的胞外区和辅助性T细胞的决定簇经肽链连接后，构建带有佐 剂作用的M2e-MAPS复合物，免疫小鼠后获得了很强的保护力和明显的抑制 病毒在呼吸道中复制的能力。这些研究结果说明，M2蛋白在机体内不仅能 刺激产生抗体，而且能引起细胞毒性T细胞(CTL)反应。因此，以M2作为抗 原，可对不同亚型的禽流感病毒产生保护性免疫，是研究交叉保护性流感疫 苗的理想候选抗原。

跨膜蛋白M2是除HA、NA外的第3种跨膜蛋白，含有97个氨基酸，分子 质量约为15ku。它的编码基因位于AIV基因组的第7个节段上，并由它的第2 个小mRNA翻译。M2蛋白不含糖基，具有高度保守性。感染细胞的细胞膜上 的A型禽流感病毒的M2蛋白与I类糖蛋白相似，即氨基端在细胞外，羧基端 在细胞内。细胞外部分有24个氨基酸(M2e)，跨膜区是由19个氨基酸组成 的疏水区，羧基端的54个氨基酸位于细胞膜内。M2蛋白是A型禽流感病毒的 一个高度保守性的跨膜蛋白(同源性达90％)，特别是氨基端的10个氨基酸是 非常保守的，在所测得的禽流感和人流感病毒中，其序列几乎完全相同。

由于氨基末端的24个氨基酸残基的保守性极高，用这24个氨基酸残基 作为表位所表达的融合蛋白可表现出很好的免疫保护性。Neirynck S等人将 M2蛋白保守性位点基因与乙肝病毒核心蛋白进行融合，制得表达质粒，对 小鼠进行腹腔注射或鼻内施用接种。试验显示这几种质粒都可诱导机体产生 对不同毒株攻击的保护作用，既抑制了病毒的生长繁殖，又降低了动物的死 亡率。