[发明专利]匀相溶胶颗粒型胱抑素C测定试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种匀相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒及其制备方法，更具体 地，涉及用于测定血清或血浆中胱抑素C的匀相溶胶颗粒型胱抑素C免疫测 定试剂盒及其制备方法。

背景技术

胱抑素C(CystatinC)是一种低分子量蛋白质，可由机体所有有核细胞产生， 产生率恒定。循环中的胱抑素C仅经肾小球滤过而被清除，是一种反映肾小 球滤过率变化的理想的内源性标志物，而肾小球的滤过率(glomerular filtration rate，GFR)是监测肾功能的一个重要指标，尤其对于肾移植的病人，快速准确 的掌握肾小球滤过率的变化是十分重要的。此外由于胱抑素C分子量大于肌 酐，且带正电荷，所以它更容易反映肾小球滤过膜通透性的早期变化，可以在 肾小球滤过率轻微降低时升高，较肌酐更敏感，作为肾功能试验优于血清肌酐， 具有重要的临床应用价值。

胱抑素C，是一种由120个氨基酸残基组成的分子量仅13KD的低分子量 分泌性蛋白质，是半胱氨酸蛋白酶抑制物超家族的成员之一。胱抑素C基因5’ 侧翼序列与“看家基因″的启动子区具有相同的特性，也属于“看家基因”即 此基因在所有组织恒定持续地转录及表达，无组织学特异性，广泛地存在于各 种体液中，如脑脊液、血液、唾液、精液等，机体胱抑素C产生率相当恒定。 而胱抑素C是一种低分子量蛋白质，可经肾小球自由滤过，肾脏是清除循环 中胱抑素C的唯一器官，所以血清胱抑素C浓度主要由GFR决定，由此可见 胱抑素C是一种理想的反映GFR变化的内源性标志物。

临床研究低分子量蛋白质(β2-微球蛋白、视黄醇结合蛋白、胱抑素C)浓度 与GFR(⁵¹Cr-EDTA清除率或其金标准^99mTc-DTPA清除率)的相关性，血清胱 抑素C、肌酐浓度诊断异常GFR的敏感性分别为78.1％及57.1％，各自浓度 倒数与GFR(⁵¹Cr-EDTA清除率)的相关系数分别为：0.81和0.50(参见非专利 文献1)。表明胱抑素C是低分子量蛋白质中与GFR最相关的内源性标志物， 甚至优于血清肌酐。血清β2-微球蛋白浓度由于在炎症、肿瘤及免疫疾病时也 可升高，故不是理想的GFR内源性标志物。而胱抑素C即使在炎症状态下， 其产生率也不会改变，血清浓度受年龄、性别、疾病的病情变化的影响较小。 说明胱抑素C的诊断准确性明显优于血清肌酐。

胱抑素C的检测方法学经历了大概4个阶段的发展过程，从最初的单向 免疫扩散到酶免疫测定，再到后来的胶乳增强法及匀相溶胶颗粒法等，几种方 法都属于免疫检测法。免疫浊度测定的基本原理是：抗原抗体在特殊缓冲液中 快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。当反应液中保持抗体过量时， 形成的复合物随抗原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增加，与一系列的标 准品对照，即可计算出待检测物的含量。但含量低分子量小的抗原抗体复合物 极难形成浊度，除非放置较长时间；如形成较大的复合物，则抗原和抗体用量 也较大，显然不符合微量化的要求。于是发展了免疫胶乳浊度测定法，是在胶 乳凝集定性试验基础上发展建立的一种非放射性均相免疫浊度测定法，其基本 原理是：将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时， 则使胶乳颗粒发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波之内不阻碍光线透过，两个 或两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过光减少，这种减少的程度与胶乳颗粒凝聚 的程度呈正比，当然也与待测抗原量呈正比，由此可测出标本中待测物的含量。 这种方法会产生免疫沉淀。后来又出现了匀相溶胶颗粒免疫测定法，其基本原 理是：将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶体金颗粒上，当遇到相应抗原时， 由于抗原抗体的相互作用使吸附抗体的胶体金颗粒发生凝聚。金颗粒凝聚后颜 色由红变蓝，在波长540nm处吸光度会逐渐降低。而这种降低的程度与胶体 金颗粒凝聚的程度呈正比，当然也与待测抗原量呈正比，由此可测出标本中待 测物的含量。但是，目前的匀相溶胶颗粒免疫测定法，其分析灵敏度还不令人 满意，期待着进一步提高该方法的检测灵敏度。