[发明专利]纳米壳聚糖衍生物及制备方法和它的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学纳米材料技术领域。具体而言，涉及纳米壳聚糖衍生物及制备方法和利用该纳米壳聚糖衍生物高选择性和特异性富集和纯化糖基化多肽/蛋白的方法。

背景技术

翻译后蛋白质的修饰是蛋白质组学中研究的热点课题。蛋白质的糖基化是最常见的、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，蛋白质的糖基化几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖，发育和分化，新陈代谢，免疫应答，肿瘤发生等，一些糖基化蛋白质作为治疗疾病的相关靶或生物标识物用于癌症的早期检测和鉴定，如癌胚抗原用于检测直肠癌，乳腺癌，前列腺癌和肺癌；CA-125用于检测卵巣癌；专一性前列腺癌胚抗原用于检测前列腺癌；Her2/neu用于检测乳腺癌；等等，因此对糖基化蛋白质的分析和鉴定具有十分重要的作用。

蛋白质糖基化的一个重要特点是不均一性，即不同的糖链可连于同一位点以及在同一蛋白质上也可有不同的位点连接不同的糖链。糖基化的不均一性给糖蛋白质的分离分析带来了很大的困难：不同糖型的同一蛋白质会在电泳上呈现弥散的条带，导致信号分散，较低丰度的蛋白质得不到鉴定；造成糖蛋白质在色谱中不能良好的分离；目前，质谱技术已经发展成为鉴定糖基化蛋白的重要工具之一，质谱在鉴定糖基化蛋白时，仍面临巨大的挑战，其具体体现是：第一，糖基化蛋白在细胞内所有蛋白中为低丰度；第二，糖基化蛋白在质谱上表现为一簇分辨率很差的峰，得不到准确的分子量。鉴于此，当前国际上的主要研究策略是利用现有技术体系，分离富集糖蛋白质/糖肽，消除糖基化的不均一性及其对质谱的影响，质量标记糖基化位点，从而扬长避短，实现大规模高通量糖蛋白质及糖基化位点的鉴定。目前，常用的糖蛋白质分离富集技术有：凝集素亲和技术、肼化学富集法、亲水相互作用色谱法等。其中凝集素亲和技术对含甘露糖基和N-混多糖的糖蛋白具有较好的亲和作用，但是对二触角的N-多糖糖蛋白的亲和作用较弱，对三，四触角的N-多糖糖蛋白没有亲和作用；而肼化学富集法需一步氧化反应，从而增加了样品制备时间和样品的复杂性。最近开发的带有苯硼酸的硅材料，对含有N-糖基化和O-糖基化的糖蛋白都具有较好的富集作用，适用所有的含不同结构，不同大小和亲水性的糖蛋白，但是其专一性和灵敏性有待提高。

壳聚糖(Chitosan)又称可溶性甲壳质、甲壳胺、几丁聚糖等，化学名为2-氨基-β-1，4-葡聚糖，它是甲壳素经脱乙酰基而得到的一种天然阳离子多糖，具有可降解性、良好的成膜性、良好的生物相容性及一定的抗菌和抗肿瘤等优异性能，广泛应用于医药、食品、化工、环保等行业，素有万能多糖的美誉(R.Jayakumar et al.Carbohydrate Polymers 62(2005)142-158)。甲壳素在自然界分布非常广，是一种廉价易得的原料。未见带有活性硼酸基官能团的壳聚糖衍生物作为固载基质来富集和纯化糖基化多肽/蛋白的报道。

发明内容

本发明的目的是提供纳米壳聚糖衍生物。

本发明还提供上述纳米壳聚糖衍生物的制备方法。

本发明也提供上述纳米壳聚糖衍生物在富集和纯化糖基化多肽/蛋白方面的应用。

纳米壳聚糖衍生物，所述壳聚糖衍生物是壳聚糖与烯酸环氧丙酯发生自聚接枝反应的产物，再与氨基取代苯硼酸进行开环加成反应得到的，所述衍生物带有活性硼酸基官能团，颗粒大小为1-300nm，优选颗粒大小为20-100nm。

所述氨基取代苯硼酸为3-氨基苯硼酸、2-氨基苯硼酸或4-氨基苯硼酸。

所述烯酸环氧丙酯为C₃-C₈直链或支链烯酸环氧丙酯，优选甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)或丙烯酸环氧丙酯。

所述的纳米壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于，按照如下操作步骤进行：

(1)将壳聚糖溶于含有0.1-20wt％酸的水溶液，再与甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯混合，加入引发剂后进行自聚接枝反应，其中，壳聚糖的含量为1.5-2.5wt％，甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯的含量为2-10wt％，反应温度为40-100℃，反应时间为0.5-4小时，得到中间体；

(2)将步骤1得到的中间体与氨基取代苯硼酸置于氯化钠和碳酸钠的水溶液中进行开环加成反应，其中，氨基取代苯硼酸的用量是中间体的1-5倍，且占反应体系的2-10wt％，反应温度为50-80℃，pH值为8-12，反应时间4-6小时，降至室温后，过滤，用水洗涤至中性，得到目标产物。

所述引发剂为偶氮二异丁腈，正丁基锂，过硫酸钾，硝酸铈铵，硫代碳酸-溴酸钾，二高碘酸铜酸钾，过硫酸氨或硫代硫酸钠中的一种或多种，其中，加入量为反应体系的1-5wt％。