[发明专利]生物转化法生产脱氧腺苷的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物转化法生产脱氧腺苷的方法。

背景技术

蒋忠良等报道了2’-脱氧腺苷全合成研究(同济大学学报：自然科学版，2007，35(9)：1264-1268)，路有昌等报道了2’-脱氧腺苷的合成(应用化工，2006，35(7)：564-565)，王晓萌等报道了2’-脱氧腺苷相关中间体的合成路线研究(学位论文)，河南师范大学和新乡拓新生化科技有限公司等申请了化学合成法生产2′-脱氧腺苷的工艺专利(中国专利200710053920.X)。以上文献都是采用化学法制备脱氧腺苷。如将6-氯腺嘌呤与1-乙酰基-3，5-二(对甲基苯甲酰基)-2-脱氧核糖和含有磷酸酚酯类化合物催化剂的有机溶剂放入反应釜中，在催化剂催化作用下缩合反应制备3’5’-二(对甲基苯甲酰基)-2’-脱氧-6-氯嘌呤核苷；再将化合物和氨甲醇放入反应釜中氨解得到2’-脱氧腺苷。由于化学法生产脱氧腺苷条件苛刻，大量使用有机溶剂，环境污染较严重，且生产成本高，工艺复杂。

目前，国内外对于生物转化法生产脱氧腺苷的文献报道较少。洪云海等报道了应用乙酰短杆菌酶法合成2’-脱氧腺苷的方法(工业微生物，2006，36(1)：30-33)，他们以乙酰短杆菌为转化菌，底物浓度为40mmol/L(10g/L)，转化率约66％。该方法中的底物腺嘌呤水溶性很低，使得底物与生物酶的有效接触十分困难，严重影响转化反应的速率和产率；起催化作用的脱氧核糖转移酶等为胞内酶，微生物细胞膜的脂质双层结构使底物进出微生物细胞很困难，反应速度和转化率较低。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物转化法生产脱氧腺苷的方法。

本发明所提供的生产脱氧腺苷的方法，是将瑞士乳杆菌种子液接入发酵培养基中发酵培养，得到粗菌体，将所述粗菌体破碎，制成细胞破碎液，向所述细胞破碎液中加入脱氧胸苷和腺嘌呤进行酶促反应，获得脱氧腺苷；所述腺嘌呤的粒度小于等于10μm。

其中，所述发酵培养基由下列重量份的物质组成：葡萄糖10-20、蛋白胨1-5、麸质粉10-25、柠檬酸胺1-2、磷酸氢二钾1-2、硫酸钠5-10、硫酸锰0.02-0.4和水1000；所述酶促反应的温度为35-50℃，优选为40-50℃。

所述发酵培养基优选由下列重量份的物质组成：葡萄糖15-20、蛋白胨4-5、麸质粉20-25、柠檬酸胺2、磷酸氢二钾2、硫酸钠9、硫酸锰0.02和水1000。

所述发酵培养的温度为30-42℃，优选为37-40℃；搅拌转速为120-160转/分钟，优选140-160转/分钟；pH值为6.0-7.5，优选6.0-6.5；发酵时间为24-36小时。

所述瑞士乳杆菌种子液与所述发酵培养基的体积比为10％-15％。

所述瑞士乳杆菌种子液是按照如下方法获得：将瑞士乳杆菌接种到斜面培养基培养制成斜面菌种，将所述斜面菌种接入发酵培养基中培养获得种子液；所述斜面培养基由下列重量份的物质组成：葡萄糖10-20、蛋白胨10-20、酵母膏3-8、柠檬酸胺1-2、磷酸氢二钾1-2、硫酸钠5-10、硫酸锰0.02-0.4，琼脂15-20和水1000。

所述斜面培养基优选由下列重量份的物质组成：葡萄糖15-18、蛋白胨18、酵母膏6-8、柠檬酸胺2、磷酸氢二钾2、硫酸钠8-9、硫酸锰0.02，琼脂20和水1000。

所述瑞士乳杆菌接种到斜面培养基培养的温度为30-42℃，优选37-40℃；pH为6.5-8.0，培养24-48小时。

所述细胞破碎液按照如下方法制备：将所述粗菌体用柠檬酸缓冲液洗涤，然后用pH6.0-7.0磷酸缓冲液悬浮，获得细胞悬浮液，超声破碎所述细胞悬浮液，获得细胞破碎液。

所述柠檬酸缓冲液的pH6.0-7.0，优选为pH6.5-7.0。所述磷酸缓冲液的pH值优选为6.0。所述细胞悬浮液中菌体的质量百分含量为15％-35％，优选为15％。

所述超声条件为功率为300-400瓦，频率为3-5次/10秒，时间为5-15分钟。

本发明是生物转化法生产脱氧腺苷，充分利用酶的高效性、专一性和温和性，与传统化学合成方法相比，具有选择性高、条件温和、工艺简单、成本低和污染小等特点。