[发明专利]一种新型肽-链接基-缀合物及其固相合成方法

说明书

技术领域

本发明属于多肽的固相合成方法及应用技术领域，具体涉及一种新型肽-链接基-缀合物及其固相合成方法。

背景技术

基于核酸的一些药物如反义寡核苷酸、肽核酸以及很有希望的小干扰RNA(siRNA)要想发展成为有用的治疗药物，提高其细胞通透性是必须解决的关键问题之一。很多技术已经被用来提高这类化合物的细胞内摄取，例如，高压静脉注射、脂质体和纳米聚合物等，但是这些方法都存在不同程度的副作用而限制其发展。

细胞透膜性肽是近些年来发展起来的新兴转运载体，已经广泛用于一些非细胞膜通透性大分子的细胞内转运。而将其用于核酸类药物细胞内转运来说，主要通过将透膜性肽与寡核苷酸共价缀合实现的。用化学方法实现缀合物生成主要有三种方法：固相逐步合成法、固相片段缩合法和液相片段缩合法。在这三种方法中，固相逐步合成法具有操作简便，底物用量少等优点。

从合成顺序上可将固相逐步合成法分成两类：1)peptide-first-oligo-next：即首先在固相上进行肽的合成，采用Boc或Fmoc策略，之后进行寡核苷酸的合成，最后进行切割及纯化；2)oligo-first-peptide-next：即首先进行寡核苷酸合成，之后进行肽的合成，多采用Fmoc策略，最后进行切割及纯化。

虽然全固相操作简单，但这两种策略都存在问题，即反应条件的兼容性问题，包括偶联条件，脱保护的条件及切割的条件。如果首先合成肽，则肽的侧链上的保护基必须在寡核苷酸合成的条件下稳定，即保证酸性稳定，没有氧化性；在寡核苷酸合成之后可以脱除，即保证碱性或Pd试剂脱除。首先这样的侧链保护基比较少，而且会对寡核苷酸合成产生影响，例如会影响偶联效率，常规的I₂氧化须改为tBuOOH氧化。另一方面，如果先合成寡核苷酸，问题同样存在。寡核苷酸对酸性敏感，Boc策略不再使用，只能采用Fmoc策略，侧链的保护基只能选取用弱酸性或催化还原的方法脱除，不仅这种保护基较少，而且如此修饰的氨基酸还需要个别制备，也阻碍了这种方法的发展。

发明内容

为了克服上述现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供一系列肽-链接基-缀合物及其固相合成方法，并且提供用于缀合肽、链接基和缀合物的各种连接基团。

为了达到上述目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明提供一系列肽-链接基-缀合物，由每端具有连接官能团的链接基缀合而成，所述链接基在一端与肽共价缀合，在另一端与缀合物共价缀合；

其中所述链接基为A为取代或未取代的苯环或碳原子，n为0、1、2、3、4或5；所述缀合物为寡核苷酸。

优选的，所述肽-链接基-缀合物具有通式(VIII)的结构

其中X为多肽序列，A为取代或未取代的苯环或碳原子，n为0、1、2、3、4或5。

所述肽是一种由氨基酸组成的合成肽。其中肽片段包括，但不限于以下序列：SEQ ID NO.：1，SEQ ID NO.：2，SEQ ID NO.：3，SEQ ID NO.：4，SEQ ID NO.：5，SEQ ID NO.：6，SEQ ID NO.：7，SEQ ID NO.：8，SEQ ID NO.：9，SEQ ID NO.：10，SEQ ID NO.：11。

根据本发明，肽片段可以是肽模拟物。

在本发明的一个优选实施方案中，肽具有透膜的性质。

所述寡核苷酸包括，但不限于：反义寡核苷酸、siRNA、miRNA，PNA，酶性核酸以及其他可以与mRNA或DNA结合的寡聚核苷酸类似物，最终发挥调节基因的翻译或转录作用。

所述反义寡核苷酸的靶基因包括，但不限于：肿瘤抑制基因的突变体(如p53、BRI、EIA和BRCAI)、致癌基因(如k-ras、c-myc和c-fos)、生长因子基因(如IGF 1、PDGF、酸性和碱性FGF，以及TGFβ)、编码与多药耐药性相关的蛋白的基因(如MDRI)。

本发明还提供一种固相合成方法，主要包括以下步骤：

A.使用式(I)的结构与式(II)的氨化CPG树脂合成延长链接臂的CPG树脂式(III)，其中m为0、1、2、3、4或5

B.在式(III)的CPG树脂上合成氨基酸受保护的肽基树脂式(IV)，其中X为多肽序列

C.将式(V)缀合于肽基树脂式(IV)，从而形成带有肽-链接基的肽-链接基树脂式(VI)，其中A为取代或未取代的苯环或碳原子，n为0、1、2、3、4或5