[发明专利]一种三羟甲基氨基甲烷配基琼脂糖介质分离多肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多肽分离纯化方法，具体的是涉及一种三羟甲基氨基甲烷配基、高浓度、高交联度琼脂糖凝胶亲水吸附色谱分离纯化多肽的方法。

背景技术

自然界存在着数量庞大种类繁多的生物活性多肽，在各种生命活动中起着非常重要的调节作用，涉及各种毒素、激素、抗菌肽、信息素、细胞因子等，广泛参与分子识别、信号转导、酶活调节、免疫调节、细胞分化及个体发育调控等过程。生物活性多肽的开发与利用已经越来越受到医药、食品、化妆品等行业的重视，特别是医药行业，已经有大量生物活性多肽作为激素、抗生素、疫苗、诊断试剂、酶抑制剂、抗肿瘤药物等通过了临床试验，投放市场，如催产素、降钙素、血管紧张肽、内啡肽等等。

我国地域辽阔，动植物资源极其丰富，具有大量待开发的生物活性多肽，仅仅海洋生物活性多肽就有数万种之多。开发多肽类药物具有其特殊优势：1)多肽分子量小，结构简单，易于化学合成或生物合成，有利于规模化、商品化；2)功能特异，合成纯度高，不产生热原，使用安全；3)易于被机体吸收，给药途径多样化(如口服、喷雾、透皮吸收等)。多肽类药物的研究已经成为目前医药行业的热点。

生物活性多肽作为药物，与作为食品添加剂或化妆品添加剂相比，要求具有更高的纯度，杂质成分不但会降低药效，还可能产生毒副作用。通常所说的生物活性多肽一般分为两种：一种是天然活性多肽，即生物组织中天然存在的活性多肽，包括抗生素、激素、毒素等；另一种是酶解活性多肽，即通过特异性蛋白酶的水解作用，从大分子蛋白中释放出的活性肽段。无论是哪一种活性多肽，在对其进行毒理、药理研究，或者精确的结构解析之前，都需要首先将其从成分极其复杂的组织提取物或蛋白水解物中分离纯化出来。在结构和功能研究清楚之后，可以通过生物合成或化学合成实现规模化生产，以满足临床需要，这时同样需要高产并且能够保持多肽生物活性的分离纯化方法，从合成混合物中分离纯化目标多肽，最终形成产品。

生物活性多肽的生产工艺可以分为粗分离和纯化两部分。

多肽的粗分离方法主要包括液-液萃取、盐析、有机溶剂沉淀、超滤等，获得了粗提物之后，再进行进一步纯化。

多肽的纯化大多采用几种色谱技术相结合的方法，包括凝胶过滤色谱、离子交换色谱、毛细管区带电泳、亲和色谱、疏水相互作用色谱、反相高效液相色谱和逆流色谱等，每种方法都有其优势和局限。通常多肽的粗分离样品经过1～2步精分离，如离子交换色谱、凝胶过滤色谱或毛细管电泳，再经过1～3次不同表面基团(C₁₈、C₈、C₄等)的反相高效液相色谱，就能够得到很好的纯化。对于那些结构不稳定、易失活的多肽，要尽可能减少分离步骤，从而实现较高的活性回收。

凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography)，也称为分子排阻色谱(size exclusionchromatography，SEC)，根据多肽分子的分子量和形状的差异，利用其在多孔凝胶介质中扩散速率的不同进行分离。选择合适的粒径、孔隙率和刚性的介质，对多肽单体和聚集态、线性肽和环肽以及在修饰程度具有微小差异的多肽都能实现很好的分辨率。但对于分子量相近甚至相同的多肽，单纯采用凝胶过滤的方法很难将其分开。

离子交换色谱(ion exchange chromatography，IEC)根据多肽分子带电状态的不同实现分离。离子交换介质种类较多，大孔树脂、均孔树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都可以作为基础材料，表面键合了不同的阴、阳离子，可选择的范围广。IEC需在高盐浓度洗脱，易发生聚合而失活的多肽则不宜采用这一方法。

反相高效液相色谱(reversed phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)是目前分辨率最高的多肽纯化方法，可以精确分辨一个氨基酸残基的差异，经常被用作最终的纯度验证步骤。尽管已经有商品化的制备级RP-HPLC色谱柱，但将RP-HPLC技术应用于规模化生产生物活性多肽，还是有困难的。第一，RP-HPLC样品载量较低，且不易放大；第二，介质的重复使用次数有限，对样品的要求较高；第三，硅胶基质结合C链基团的分离介质，用作临床用药的生产，其生物相容性与生物安全性没有葡聚糖、琼脂糖类的介质高。

鉴于以上常用的多肽分离方法都不能实现一步分离，操作步骤繁琐，而RP-HPLC的样品载量、重复使用次数和生物安全性也限制了其规模化生产，需要开发更加高效高产而且易于规模化的多肽分离方法。目前还没有将吸附色谱应用于多肽分离的报道。