[发明专利]一种三羟甲基氨基甲烷配基琼脂糖介质分离多肽的方法

权利要求书

1、一种三羟甲基氨基甲烷配基琼脂糖亲水吸附色谱分离多肽的方法，利用三羟甲基氨基甲烷配基、高浓度、高交联度的琼脂糖凝胶介质与目标多肽之间产生的强度不同的氢键相互作用，从生物组织提取物、蛋白水解物或多肽合成混合物中分离纯化多肽。

2、如权利要求1所述的一种三羟甲基氨基甲烷配基、高浓度、高交联度琼脂糖凝胶亲水吸附色谱分离纯化多肽的方法，包括如下的步骤：

1)制备生物组织粗提物、蛋白水解物或多肽合成混合物；

2)选择琼脂糖凝胶亲水吸附色谱介质：以三羟甲基氨基甲烷配基，以10-30μm粒径、12％浓度的高交联度琼脂糖凝胶为基质的分离介质；

3)选择流动相：水，乙醇-水，乙醇-乙酸-水，乙醇-三氟乙酸-水，甲醇-水，甲醇-乙酸-水，甲醇-三氟乙酸-水，乙腈-水，乙腈-乙酸-水，乙腈-三氟乙酸-水等体系，采用不同溶剂配比；

4)选择洗脱方式：可采用等度洗脱，线性梯度洗脱或分步的等度洗脱分离多肽混和物；

5)将步骤2选定的介质进行适当的预处理：琼脂糖凝胶介质在20％乙醇保存液中装柱，平衡到初始流动相即可使用；

6)将步骤3)选定并配制好的流动相超声脱气或真空脱气10-30min，室温静置0.5-1h；

7)使用步骤6)配制好的流动相平衡亲水吸附色谱柱两个柱体积，采用步骤4)的洗脱方式，线性流速20～100cm/h，紫外检测器210-280nm或采用示差检测器在线监测，自动收集馏分；

8)将步骤7)收集的馏分冷冻干燥，检测纯度：采用反相高效液相色谱C18柱，以甲醇-水、甲醇-乙酸-水、甲醇-三氟乙酸-水或乙腈-水、乙腈-乙酸-水、乙腈-三氟乙酸-水为流动相，采用线性梯度洗脱，以B相溶解样品，紫外检测器280nm在线监测，计算多肽纯度和收率；

9)步骤8)获得的纯度95％以上的馏分，质谱检测确定分子量及氨基酸序列，并利用数据库进行比对；

10)具有特殊生物活性的多肽在分离前后测定其活性，计算多肽活性回收率。