[发明专利]一种可降低发酵副产物的乙醇发酵工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及一种可降低发酵副产物的乙醇发酵工程菌，本发明还涉及所述工程菌的制备方法及其在发酵生产乙醇中的应用。

背景技术

许多植物，尤其是一些常被废弃的植物中纤维素含量较高，如在农作物秸秆和残留物中，纤维素和半纤维素的含量可占到干重的75％以上。如果能用于发酵生产乙醇，是非常好的利用方式。

纤维素主要是由六碳糖和五碳糖，如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖等组成。

大肠杆菌含有利用六碳糖和五碳糖的所有必需酶，可发酵某些六碳糖和五碳糖。但是利用未经改造的野生型大肠杆菌发酵生产乙醇，产率很低，且副产物多，在产业上并不可行。

中国专利200710177003.2公开了一种大肠杆菌乙醇发酵工程菌，将大肠杆菌JML09通过乙醇的多代筛选得到突变株，然后转入了运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因II和丙酮酸脱羧酶基因，在分别以木糖和葡萄糖为碳源发酵生产乙醇时，乙醇产率达到了理论产率的79％和87％。

但是，已知在六碳糖和五碳糖的发酵过程中会积累很多有机酸类中间代谢的副产物，如甲酸和乳酸等，乙醇仅占很少一部分。副产物的问题不仅影响了乙醇产量，还存在后续处理时与副产物分离的工艺问题。

因此，设法在发酵时降低副产物，在利用纤维素发酵生产乙醇的技术中是亟待解决的问题。

发明内容：

本发明的目的是提供一种新型大肠杆菌乙醇发酵工程菌，使其在用五碳糖和六碳糖做底物发酵生产乙醇时能减少副产物，从而提高乙醇产率。

具体目的是对大肠杆菌的乙醇代谢途径进行改造，敲除积累副产物的基因，减少发酵时副产物的形成；同时引入高效的乙醇发酵途径，使乙醇成为主要发酵产物。在高浓度乙醇下依然能够保持较高的发酵速率，而且有较高的乙醇产率。

本发明用以下两种方式达到了本发明的上述目的：

1、对产乙醇的大肠杆菌突变株进行了基因改造。

将大肠杆菌通过Red重组系统将丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脱氢酶基因突变，从而不能积累甲酸和乳酸等副产物，得到减少副产物的突变株。所述Red重组系统来源于Datsenko and Wanner(见Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97(12)，6640-6645)。

2、在去除副产物的突变株中转入了运动发酵单胞菌基因

所述运动发酵单胞菌基因是产乙醇的乙醇脱氢酶基因II和丙酮酸脱羧酶基因，两个基因在可被大肠杆菌RNA聚合酶高效识别的强启动子Ptac启动下发生共表达，得到高产乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌。

由于引入同型乙醇发酵途径，控制其细胞内的碳代谢向生成乙醇的方向进行，使得其发酵主产物为乙醇。

在本发明的一个实施例中，大肠杆菌乙醇发酵工程菌的具体制备方法是：

1、通过Red重组系统分别突变失活大肠杆菌MG1655丙酮酸甲酸裂解酶和乙醇脱氢酶基因，从而减少副产物甲酸和乳酸的产生，在无氧的条件下使其碳代谢和能量代谢流向生产乙醇的方向，达到积累乙醇的目的。

2、将包含有SD序列的运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因经过PCR克隆后连接到pGEM-T easy载体上，经过酶切后置于含有可被大肠杆菌RNA聚合酶高效识别的强启动子Ptac的表达载体pZY507上，使得乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因在大肠杆菌中发生共转录和共表达，得到大肠杆菌乙醇发酵工程菌。

经实验证实，用本发明所提供的大肠杆菌乙醇发酵工程菌在发酵五碳糖和六碳糖生产乙醇时，其发酵葡萄糖转化率达到理论产值的(97％)发酵木糖的转化率达到理论产值的(96％)

本发明的优点是：

1.将丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脱氢酶基因突变，从而不能积累甲酸和乳酸等副产物，在发酵生产乙醇时降低了副产物的含量；

2.同时共同转录和表达运动发酵单胞菌的外源基因，乙醇成为主产物。

本发明以具有乙醇耐受性大肠杆菌MG1655构建发酵乙醇的双突变株，从而降低副产物的积累，使得工程菌能够生产高浓度乙醇，同时可以耐受高浓度乙醇；

利用了含有能被大肠杆菌RNA聚合酶高效识别的强启动子Ptac的表达载体使运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因在大肠杆菌耐乙醇突变株ET1中共同转录和表达。使得其发酵主产物为乙醇，在提高乙醇产率的同时降低了后续纯化，如蒸馏过程中的投入。

具体实施方式

实施例1耐乙醇大肠杆菌乙醇发酵工程菌的制备

A、大肠杆菌乙醇耐受株MG1655的筛选