[发明专利]一种联合检测五种烈性病原菌的基因液相芯片及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种联合检测炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、土拉弗朗 西斯菌、布鲁菌和类鼻疽伯克霍尔德菌五种烈性病原菌的基因液相芯片 的方法，本发明还涉及利用所述的基因液相芯片进行检测的方法。

背景技术

可能用于生物恐怖的烈性病原体有很多种，包括炭疽芽孢杆菌、鼠 疫耶尔森菌、土拉热弗朗西丝菌、布鲁菌、鼻疽伯克霍尔德菌、类鼻疽 伯克霍尔德杆菌、出血热病毒、肉毒毒素和蓖麻毒素等。

现有的病原体检测技术，如生物传感器或胶体金技术等均见于生物 恐怖因子的检测。这些技术或灵敏或特异，但受限于多重检测能力，难 以对可疑样本进行多因子筛检。悬浮芯片(suspension array)也称液相 芯片(liquid array，liquid chip)，结合了PCR技术的灵敏度和核酸探 针技术的特异性，且在一个反应孔内即可对100种不同的PCR产物进行检 测，检测时间短，通量大，可实现对疑似样本多靶标的同时筛查。

炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)是人兽共患传染病-炭疽的病原 体，为粗大的革兰氏阳性杆菌，具有强烈的致病性、传染性和生存能力。 鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)是严重危害人类健康的烈性传染病- 鼠疫的病原体，革兰氏阴性卵圆形杆菌，其天然宿主是啮齿类动物，通 过鼠蚤传播。。土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)是急性传染 病-土拉菌病(兔热病)的病原体，革兰氏阴性球杆菌，毒性强，传播快。 布鲁菌(Brucella)是布鲁菌病(brucellosic)的病原体，一组微小的球 杆状的革兰氏阴性菌，自然界中抵抗力较强。类鼻疽伯克霍尔德菌 (Burkholderia pseudomallei)是人兽共患病-类鼻疽病的病原体，革 兰阴性杆菌，自然界中抵抗力较强。

本发明的炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、土拉弗朗西斯菌、布鲁菌 和类鼻疽伯克霍尔德菌多重检测液相芯片，实现重要病原菌的多元化、 高通量筛查，对于预防和控制跨境传播传染病的传播、应对生物恐怖、 维护国家和人民生命健康安全具有重要的意义。

发明内容

本发明涉及一种联合检测炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、土拉弗朗 西斯菌、布鲁菌和类鼻疽伯克霍尔德菌的基因液相芯片及其制备方法， 该基因液相芯片可以用于同时检测炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、土拉 弗朗西斯菌、布鲁菌和类鼻疽伯克霍尔德菌五种病原体。本发明还涉及 利用所述的基因液相芯片进行检测的方法。

现有的病原体检测技术受限于多重检测能力的困境，而许多可疑样 本需要进行多靶标的筛查，本发明的目的是通过提供一种同时检测五种 烈性病原菌液相芯片及其制备方法和应用，为五种烈性病原菌的快速检 测提供一种灵敏、特异、快速、可靠的方法。

本发明的工作原理是：选择五种细菌的特异基因片段，设计针对五 种细菌的特异性引物；然后设计位于扩增区域内五种细菌的特异性探针， 探针偶联不同编号的编码微球，制备出可对上述五种细菌同时检测的液 相芯片，在应用时，首先使用上述引物对五种细菌进行多重PCR扩增，然 后加入扩增的PCR产物，使微球上的捕获探针捕获相应的PCR产物，再与 链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)反应，通过LUMINEX检测系统(如LUMINEX 100， LUMINEX 200，Bio-plex，LIQUICHIP等)，实现对五种细菌的一次性检 测。

本发明的液相芯片包括编码微球、与编码微球偶联的捕获探针、生 物素化的引物、PCR反应体系、链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)。

本发明所述的PCR反应体系包括10×PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合 酶(Taq酶)、生物素化的引物、去离子水。

本发明所用的编码微球可以来源于LUMINEX、BIO-RAD、QIAGEN、GENE 等公司，可以选用任意编号作为编码微球，例如选自上述公司的第044， 042，032，025，034，027号微球。

本发明的引物可以在本领域技术人员公知的范围内采用常规生物技 术进行筛选、设计或购买，本发明的引物序列可以例如是： 炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)(简称炭疽菌)：两对引物，其中一 对位于染色体、一对位于质粒，序列如下：

BA-1-F：5’-TGGACGCATACGAGACATAAT-3’