[发明专利]一种联合检测五种烈性病原菌的基因液相芯片及其检测方法

权利要求书

1.一种联合非诊断性检测多种病原体的方法，其特征在于，该方法使 用液相芯片，所述芯片包括微球、捕获探针、生物素化的引物、PCR反 应体系、链亲和素-藻红蛋白，所述病原体为炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森 菌、土拉弗朗西斯菌、布鲁菌和类鼻疽博克霍尔德菌；其中，使用的引 物序列如下：

炭疽芽孢杆菌：两对引物，其中一对位于染色体一对位于质粒，序列如 下：

BA-1-F：TGGACGCATACGAGACATAAT

BA-1-R：TGCTTTAGCGGTAGCAGAGG

BA-2-F：TTTCATAATCATGGATTTCCCG

BA-2-R：TTACCCAACATCATCTTCGCA

鼠疫耶尔森菌：位于染色体，序列如下，

YP-F：ACTCAATGTTGTGACGAGGATG

YP-R：TTACTTCTAATGCCATCAGGTAGC

布鲁菌：序列如下，

Bru-F：TGGCTCGGTTGCCAATATCAA

Bru-R：GCGCTTGCCTTTCAGGTCTG

土拉热弗朗西丝菌：fopA，序列如下，

FT-F：GGGCAAATCTAGCAGGTCAAG

FT-R：GCTGTAGTCGCACCATTATCCT

类鼻疽博克霍尔德菌：序列如下

BP-F：CGATCTCGTCAAGGTGTCGG

BP-R：CCCCAGTTCATCTGATACTTGC

使用所述引物对所述病原体进行多重PCR扩增，然后加入扩增的PCR 产物，使微球上的捕获探针捕获相应的PCR产物，再与链亲和藻红蛋白反 应后进行探测，该方法中所用捕获探针序列如下：

炭疽菌探针1：GAAGAACGCAGGCTTAGATTGGT

炭疽菌探针2：CTCGCTTTCATCGCATTTCTCCC

鼠疫菌探针：AACAGTAAGCATCCAGTCGTTCATA

布鲁菌探针：TTACGCAGTCAGACGTTGCCTAT

土拉菌探针：TGCTGGTTTAACATGGTTCTTTGG

类鼻疽菌探针：AGGTCAATTTCCCGAACAAGACT。

2.如权利要求1所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述的PCR反 应体系包括10×PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、生物素化的引物、 去离子水。

3.如权利要求1-3任一项所述的非诊断性检测方法，其特征在于，该 方法包括步骤：

1)、待检测样本核酸的提取；

2)、多重PCR反应，配制一定组分浓度的30μl PCR反应体系；

3)、捕获探针捕获PCR产物：将偶联有探针的微球与生物素化标记的多 重PCR产物混合，在95℃变性5～10分钟，45～60℃杂交10～30分钟，探 针即可特异性捕获对应的PCR产物，然后再加入链亲和素-藻红蛋白。

4.如权利要求1所述的非诊断性检测方法，其特征在于，在引物合成时 将序列5’端进行生物素标记。

5.如权利要求1-3任一项所述的非诊断性检测方法，其特征在于，在 所述的PCR体系中，引物对的浓度分别为60-150nmol/L。

6.如权利要求6所述的非诊断性检测方法，其特征在于，在所述的PCR 体系中，dNTPs的浓度为0.05-0.5μmol/L。

7.如权利要求1-3所述的非诊断性检测方法，其特征在于，在所述的 PCR体系中，Taq酶浓度为1-5U/30μl。