[发明专利]牡丹的一种DNA指纹图谱及其获取方法与专用引物

说明书

技术领域

本发明涉及牡丹的一种DNA指纹图谱及其获取方法与专用引物。

背景技术

牡丹属于芍药属的木本类群，是中国特有的传统名花，素有“花王”之称。传统的杂交育种法周期长，无法早期筛选目标性状，严重限制了培育新品种的速度。分子标记技术能够将标记与植物性状相联系，为牡丹育种提供了一种新手段。利用DNA标记辅助选择育种将给传统的杂交育种带来革命性的变化。传统的育种选择是对表型性状的变异进行选择，但有些重要性状(如花色、花型等与观赏品质密切相关的性状)无法在早期检测出来，分子标记技术就可以对种子以及幼苗进行DNA多态性检测，根据与目的基因相关的标记进行选择，能提高选择的准确度和可靠性，缩短育种周期，提高育种效率，且相当简便。

目标区域扩增多态性(target region amplified polymorphism，TRAP)是利用生物信息学工具和表达序列标签数据库信息，产生目标候选基因区多态性标记。通过对目标区域PCR扩增，产生围绕目标候选基因序列的多态性标记。TRAP是一种新型分子标记，具有简单、高效、高共显性、重复性、易测序等优点，克服了其它标记重复性差、检测位点少、分析程序复杂等缺点。由于牡丹是木本类植物，育种周期一般5年以上，TRAP标记技术的应用可以缩短牡丹的育种周期，减少育种的盲目性，提高育种效率。

发明内容

本发明的目的是提供牡丹的一种DNA指纹图谱及其获取方法与专用引物。

本发明提供了一种获取牡丹DNA指纹图谱的专用引物，专用引物由固定引物和随机引物组成；所述固定引物是序列表的序列1；所述随机引物是序列表的序列2。

本发明还提供了一种获取牡丹DNA指纹图谱的方法，包括如下步骤：

1)提取牡丹的基因组DNA；

2)以基因组DNA为模板，利用所述专用引物进行PCR扩增；

3)将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离DNA标记，用EB染色显示牡丹的DNA指纹图谱。

所述步骤1)中，所述牡丹的基因组DNA可来自牡丹的任何器官，优选来自叶片，最优选来自幼嫩叶片。

所述步骤2)中，PCR反应体系中Mg²⁺的浓度为2-2.8mM，每条引物的浓度为0.2-0.4μM。

所述步骤3)中，电泳采用6.5-8.7％的聚丙烯酰胺凝胶。6.5-8.7％指的是凝胶浓度T(％)，即凝胶溶液中单体丙烯酰胺和交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺的总质量浓度。

本发明还保护一种获取牡丹DNA指纹图谱的试剂盒，该试剂盒含有所述专用引物。

所述试剂盒还可包括PCR反应的常规试剂、聚丙烯酰胺电泳的常规试剂和EB染色的常规试剂。所述试剂盒优选包括聚丙烯酰胺、DNA聚合酶和Mg²⁺离子。

利用所述方法得到的牡丹DNA指纹图谱也属于本发明的保护范围。

本发明的特点是：所获得的标记来自表达序列标签(expression sequence tags，ESTs)，通过一系列优化步骤建立了TRAP分子标记技术，获得了扩增效果好且分辨率较高的TRAP指纹图谱，为提高牡丹选择育种的准确性和效率，缩短育种周期，及采用现代生物技术进行牡丹的分子标记辅助育种奠定了技术基础。

使用本发明的专用引物和本发明的方法获得的牡丹DNA指纹图谱多态性高、共显性高、重复性好，将在牡丹的分子标记辅助育种中发挥重要作用。

附图说明

图1为专用引物获得的TRAP标记的DNA指纹图谱。

牡丹样品从左至右依次是：卵叶牡丹、黄牡丹、紫牡丹、矮牡丹、紫斑牡丹、狭叶牡丹、大花黄牡丹、‘海黄’、‘金阁’、‘白王狮子’、‘芳纪’、‘金岛’、‘中川粉’、‘花和尚’、‘火焰’、‘藕断丝连’、‘轻罗’、‘凤丹’、‘垫单2’、‘胭脂图’、‘雪莲’、‘黑花魁’、‘琉璃贯珠’、‘小叶紫’、‘冠世墨玉’、‘湖蓝’、‘蓝月’、‘秀群芳’、‘水晶白’、‘古城春色’、‘少女裙’、‘青龙镇宝’、‘黄丽’、‘丝绒红’、‘五彩蝶’、‘洛阳红’、‘首案红’、‘豆绿’、‘姚黄’、‘二乔’、‘锦袍红’；箭头指示的是100bp plusDNA ladder marker，购自北京全式金生物技术有限公司。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中所用的41个牡丹样本如下：