[发明专利]一种定量检测猪肺炎支原体的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和病原体定量检测技术领域。具体而言，本发明涉及用于检测猪肺炎支原体的实时荧光定量PCR引物及探针，以及使用其进行定量检测的方法。更具体地说，是对肺炎支原体p110基因设计的实时荧光定量的PCR引物及探针，以及使用其进行定量检测的方法。

背景技术

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是引起猪地方流行性肺炎(SwineEnzootic Pneumoniae，EP)的主要病原。猪地方流行性肺炎在又称猪气喘病，具有高发病率，低死亡率的特点，发病后可出现慢性干咳，生长缓慢，发育迟缓等特点，感染后可引起猪免疫力降低，从而导致其他病原如胸膜肺炎放线杆菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒、肺炎巴氏杆菌等混合感染，引发猪呼吸道综合征或者其他疾病，严重危害养猪业的发展。

Mhp分离困难，需要较长时间，且分离效率较低。即使分离成功，Mhp菌体特征不明显，显微镜观察菌体无法得到明确的结果。Mhp的固体菌落直径仅500μm，菌落特征与其他支原体菌落特征区别不明显(毕丁仁，“软皮体纲内霉形体的重新分类及最新命名”，1997年兽医微生物学学术年会论文集，第68-71页)，因此分离培养难以成为Mhp的主要诊断方法。在分子生物学方法得到充分发展前，血清学诊断是Mhp的主要诊断方法，现在仍然被广泛使用，主要有：免疫荧光技术，免疫酶技术，凝集试验，放射免疫酶试验，补体结合试验，间接血凝试验以及ELISA。其中以间接血凝试验、补体结合试验、ELISA和放射免疫酶试验较为常用。

随着分子生物学检测技术的发展，针对Mhp的诊断方法主要集中于DNA水平上的检测，包括核酸探针检测和PCR检测。Stemke等(Molecular and Cellular Probes.1989，3(3)：225-232)将Mhp DNA的EcoR I酶切片断随机克隆后，用重组产物制成探针，该探针虽然在严格杂交条件下对Mhp特异，但易与絮状支原体产生交叉反应，可检测到10pg的DNA，但无法直接检测到病肺中的Mhp DNA。随后，有一系列同位素、地高辛标记的探针被开发出来(AhrensP等，Letters in Applied Microbiology，1991，12(6)：249-253)；Satoshi Futo等，Journal of ClinicalMicrobiology，1992，30(6)：1509-1513；Kwon D等，Veterinary Pathology，1999，36(4)：308-313)。目前核酸探针主要用于基因克隆和克隆产物的鉴定，用于临床病例的检测，其敏感度和特异性尚需要更进一步的发展，而且探针检测步骤复杂。于是，后来发展出了灵敏度更高、操作更为简便的PCR检测方法(Blanchard等，Molecular and cellular probes.1996，10(1)：15-22；Baumeister等，Journal of Clinical Microbiology，1998，36(7)：1984-1988；Sorensen等，VeterinaryMicrobiology，1997，54：23-24)。随着nested PCR方法的出现，PCR检测Mhp的灵敏度和特异性进一步提高，同时临床样品的可检测时期也被延长(Stemke等，Molecular and CellularProbes.1989，3(3)：225-232；Stark等，Applied and Environmental Microbiology，1998，64(2)：543-548；Calasmiglia等，Veterinary Microbiology，2000，76(3)：299-303)。

Real Time PCR即实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法，是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术(Montgomery R A等，Cytokine，1997，9(10)：717-726)，又称荧光定量PCR。