[发明专利]一种定量检测猪肺炎支原体的方法

权利要求书

1.用于对猪肺炎支原体培养物进行实时荧光定量PCR检测的引物对及探针，其中所述的引物对及探针特异性针对猪肺炎支原体的P110基因的保守区域。

2.权利要求1所述的引物对和探针，其中所述引物对及探针的序列为：

P110realF：AGGATACAAACTGAGAAACCGAGCTA

P110realR：CAAGACCGAGTGGGTATGACCT

探针：TGGACAGATCGGTGATACAACCCCACA

3.一种对猪肺炎支原体进行定量检测的实时荧光PCR检测方法，该方法包括下列步骤：

1)菌株的培养；

2)对Mhp的基因组的提取；

3)向提取得基因组样品加入权利要求1所述引物对及探针，以及PCR扩增用的Premix ExTaq^TM(2×)、DDW，得到PCR扩增反应液；

4)将装有PCR扩增反应液的PCR管置于荧光PCR仪上；

5)根据所用的荧光染料类型，选择对应的荧光通道，进行荧光PCR扩增，记录各检测样本的PCR扩增循环数(C_t)；

6)根据各样本的反应C_t值，按照标准曲线判定待检样本中Mhp的拷贝数。

4.权利要求3所述的实时荧光PCR检测方法，该方法使用权利要求2所述的引物对及探针。权利要求3所述的实时荧光PCR检测方法，其中所述的基因组提取包括：

1)将1ml Mhp支原体培养物12000rpm室温离心10min，弃上清；

2)向沉淀中加入300μL蛋白酶K裂解缓冲体系(10mM Tris-EDTA[pH＝7.5]，0.5％[wt/vol]SDS，100μg/ml蛋白酶K)中，充分悬浮后60℃消化1h；

3)加入5M NaCl 50μL，CTAB(10％[wt/vol]，0.7M NaCl)40μL，混匀后65℃作用10min；

4)加等体积苯酚：氯仿，轻轻混匀，12000rpm 4℃离心5min；

5)小心吸取350μL上层水样到另一空离心管中，加1/10体积的3M NaAC混匀后再加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，4℃放置2h或过夜；

6)12000rpm，4℃离心10min；

7)弃上清，用700μL 75％酒精洗涤沉淀，将离心管倒置于吸水纸上，使酒精彻底干燥；

8)加30μL-50μL灭菌DDW溶解，分装后-20℃保存。

5.权利要求3所述的实时荧光PCR检测方法，其中荧光PCR扩增条件为：95℃3分钟预变性，95℃5秒变性，60℃30秒复性及延伸，变性及复性过程重复共40个循环。

6.权利要求1或2所述引物对及探针在用于猪肺炎支原体的检测中的用途。