[发明专利]一种改进的促进小鼠克隆胚胎发育的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高小鼠克隆胚胎发育率的方法，该方法为一种连续培养方法-D培养法，本发明还涉及两种提高小鼠克隆胚胎发育率的培养体系，使用所述培养体系获得体细胞克隆动物的方法，以及使用所述培养体系获得胚胎干细胞的方法。 

背景技术

近年来，体细胞核移植(SCNT)技术在很多物种中取得了成功，但是SCNT的效率仍然比较低。研究认为，体细胞核移植技术(SCNT)的低效性在很大程度上是由供体核重编程不完全造成的(Jouneau et al.，2003；Latham 2004)。为了提高重编程效率，人们研究尝试了很多的方法，包括重构胚的激活时机和DMSO的影响(Wakayama et al.，2001)，胞质分裂抑制剂的影响，去核和注核时机的影响(Wakayama et al.，2003)，电融合法(Ogura et al.，2000)以及显微操作技术方面包括压电陶瓷辅助(PEM)的两步法(Wakayama et al.，1998)和一步法(OSM)(Zhou Q et al.，2003)，但都没有取得显著的效果。考虑到DNA甲基化和组蛋白乙酰化都是影响体细胞重编程和克隆胚胎发育的重要表观遗传标记。人们研究了用病理学药剂改变供体细胞和胚胎的表观遗传修饰来提高体细胞被卵胞质重编程的能力。其中在SAH(S-腺苷同型半胱氨酸，S-adenosyl-homocysteine)和TSA(组蛋白去乙酰化酶抑制剂，trichostatin A)上的试验表明，SAH处理供体细胞后能够显著提高 克隆胚胎的体外发育率，而TSA处理供体细胞或者重构胚均能够显著提高克隆效率和重编程效率(Rybouchkin et al.，2006；Byeong-Gyun Jeon et al.，2008；Kishigami et al.，2006)。但是这些药物对克隆胚胎长期影响尤其是在治疗性克隆中能否安全应用还有待研究。 

研究发现，体外培养环境对胚胎发育有重要的影响。那么，改变体外培养条件或者优化体外培养液是否可以提高克隆胚胎体外发育能力呢？Chatot CL等通过对小鼠2细胞胚胎阻滞的研究发现，培养液中的葡萄糖在胚胎发育早期可能抑制一些关键的代谢过程，而谷氨酰胺是胚胎早期发育过程中首选的能量来源(Chatot CL et al.，1989)。传统上认定的那些在体外发育时2细胞发生阻滞或者不阻滞的小鼠品系的胚胎差异也可能与培养环境的渗透压有关(Hadi etal.，2005)。Kamjoo M等比较了小鼠品系和培养液对正常受精囊胚凋亡的影响，结果发现，遗传来源和培养液中的化学物质对凋亡的发生是同等重要的(Kamjoo et al.，2002)。体细胞胞质中的各个独立区域和分子团是依培养环境中成分的变化而重新定位的(Gajewskiet al.，2003)，表观遗传状态会受到培养环境的影响，例如培养液中的血清能改变与基因组印迹相关的表观遗传信息(Khosla et al.，2001)。小鼠合子中H19基因的表达可被体外培养环境所改变(Doherty et al.，2000)。Michele等研究发现，与那些正常受精合子不同，克隆胚胎的囊胚率和多能性标记Oct4mRNA在囊胚中的区域性分布高度依赖于核移植后的培养环境。第一个细胞周期以后，体细胞核的表观遗传修饰仍在继续；重构胚中核重塑的改变是有利于还是不利于建立合子基因程序要依赖于培养液中的特异的物质(Michele Boiani et al.，2005)。Heindryckx等用CZB、G1/G2和KSOM/G2培养克隆和孤雌胚胎的研究发现，克隆胚胎和孤雌胚胎对体外培养环境非常敏感，选择的培养液是否合适将显著影响胚胎的体外发育(Heindryckx et al.，2001)。由此可见，体外培养环境对 小鼠各种来源的胚胎的发育是非常关键的，这也提示我们除了以上报道的提高克隆效率的方法外，研究和选择更好的胚胎体外培养体系将是影响小鼠胚胎尤其是克隆胚胎体外发育的重要因素。 

因此，需要研究和筛选更好的胚胎体外培养方法和培养基来提高克隆胚胎的发育率，利用新的培养方法可为克隆动物的生产、以及克隆胚胎干细胞的获得带来新的发展契机。 

发明内容

为了解决以上问题，我们将不同的培养液组合使用，各取优点，寻找更能促进小鼠克隆胚胎体外发育的培养液，我们首次发现一种连续培养方法-D培养法，能够显著地提高小鼠克隆胚胎的发育率。