[发明专利]一种包被金黄色葡萄球菌蛋白的免疫磁性微球的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫磁性微球的制备方法，特别是涉及一种包被金黄色葡萄球菌蛋白的免疫磁性微球的制备方法，本发明还涉及这种免疫磁性微球的应用。 

背景技术

金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal Protein A，PROA)是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。它能与人及多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合，不同种属其亲和性各不相同；PROA除与IgG结合外，还能与血清中少量的IgM和IgA结合。由于该蛋白具有免疫球蛋白Fc部位结合的特异性，因此被广泛的应用于种属及亚类抗体的检测和分离纯化、酶的固定化和各类生物分子的检测等研究中。 

在以往的研究中，应用于抗体分离以及微生物检测的磁性微球类产品多为物理吸附和化学交联法。物理吸附的方法存在PROA易脱落，吸附抗体不稳定等缺点，而化学交联法则一般是利用化学反应将磁性微球表面材料的特征性官能团和PROA结合，再利用PROA与IgG生物特异性结合的特点实现吸附抗体的目的，这种方法虽然克服了上述缺点，但是由于引入化学物质造成的不必要空间位阻，使磁性微球吸附抗体效率低下，严重影响了磁性微球的应用。所以及其需要操作简单，安全可靠，且高效稳定的方法来解决此领域目前存在的问题。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种包被金黄色葡萄球菌蛋白的免疫磁性微球的制备方法，以使PROA固定在磁性微球表面，可以用于分离纯化 各种兔源lgG，分离纯化抗体步骤简单，方法简便，而且免疫磁性微球可以多次使用。 

为解决上述技术问题，本发明提供了一种包被金黄色葡萄球菌蛋白的免疫磁性微球的制备方法，其包括如下步骤： 

a将1～5体积份的磁性微球置入50体积份的金黄色葡萄球菌发酵裂解液中； 

b向上述溶液中加入1～5体积份1～3％Tween和1～5体积份0.3～0.8％的戊二醛溶液； 

c向上述溶液中加入5～25体积份0.2～0.8％的NaBH₄； 

d磁性分离得到免疫磁性微球。 

上述免疫磁性微球的制备方法，其中，步骤a中的磁性微球可以采用现有技术中的磁性微球，也可以采用下述方法制备的磁性微球： 

a将纤维素和甲基氧化吗啉溶液以重量比5～10∶100混合均匀，其中甲基氧化吗啉的含水量低于11％，所用纤维素可以为微晶纤维素或脱脂棉花； 

b将5～8重量份的FeCl₂·4H₂O溶于100重量份的去离子水中，加入70～80重量份的聚乙二醇，之后加入100～110重量份质量浓度为15％的H₂O₂，混合均匀后，加入6N的NaOH溶液调解pH值至10.5，溶液在50～60℃反应，得到棕黑色磁流体。 

c将步骤a和b制得的纤维素溶液和棕黑色磁流体以体积比3～8∶1混合加入到含有1～2.5％(质量浓度)Tween的10～15体积份的四氯化碳溶液中，在8000～12000rpm转速下搅拌6～15分钟，之后在400～2500rpm下，于45～60℃下搅拌50～120分钟，磁性分离磁性微球。 

上述的免疫磁性微球的制备方法，其中，所述步骤b中将溶液涡旋30～60分钟，静置40～80分钟。 

上述免疫磁性微球的制备方法，其中，所述制得的免疫磁性微球的粒径为5～7微米。 

本发明还提供了一种兔lgG的纯化方法，其包括如下步骤， 

a在兔lgG血清中加入前述制备方法制得的免疫磁性微球，震荡后静置， 磁性分离免疫磁性微球； 

b将分离的免疫磁性微球用pH为7.4磷酸盐缓冲液洗涤，之后放入层析装置中； 

c用pH值为2.5的甘氨酸-盐酸缓冲液洗涤，搜集洗脱液，中和洗脱液； 

d将中和后的洗脱液透析，将透析后的液体冻干得到抗体纯品。 

上述兔lgG的纯化方法，其中，所述步骤d中将中和后的洗脱液在4℃下去离子水中透析12小时。 

本发明进一步还提供了一种兔抗人血清白蛋白lgG-PROA-免疫磁性微球的制备方法，其包括如下步骤： 

a在4～7体积份的兔抗人血清白蛋白血清中加入1～2.5体积份的前述方法制备的免疫磁性微球，震荡后静置，磁性分离磁性微球； 

b用pH为7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤磁性微球后，加入1～2.5体积份0.1～0.5％的戊二醛溶液，震荡后静置，分离磁性微球；