[发明专利]狂犬病街毒株HN10全基因组序列及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及狂犬病街毒序列，具体的说是狂犬病街毒株HN10全基因组序列，及其制备方法和用途。

背景技术

狂犬病是死亡率为100％的疾病，对人们的健康构成了很大的威胁，了解狂犬病毒分子流行病学有助于控制狂犬病毒流行，对狂犬病街毒株进行核苷酸的测序并进行分析成为分子流行病学的有力工具。目前，狂犬病街毒株的基因组全长序列的测定是一个很难的技术，主要是狂犬病毒基因组全长约12kb，碱基突变的比例较大，在既要保证序列准确性，又要在以尽量很少步骤的情况下得到全长基因组序列，两者之间一直很难平衡。

针对上述现有技术存在的问题，目前急需一种有效、准确可靠的全基因组测序方法，并通过该方法得到狂犬病街毒全基因组序列。

发明内容

为了改进和弥补现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种可靠准确的测序方法，并提出该方法测序得到的狂犬病街毒株HN10全基因组序列。

本发明的另一目的在于提出一种所述狂犬病街毒株HN10全基因组序列的用途。

本发明的发明思路为：本发明发明人经过长时间的实验研究，利用分子生物学的方法，对病毒的基因组全长进行了分段，并针对该分段设计了特异性扩增引物，通过对多个狂犬病毒全基因组序列的比对，选择狂犬病毒保守区域的核苷酸序列进行引物设计，引物3’末端尽可能终止在兼并密码子较少的氨基酸位置且最后一个碱基终止在氨基酸密码子的第二碱基，共设计24对引物用来扩增狂犬病毒HN10的全基因组，引物扩增片段一般不超过1.1kb；引物设计完成后针对目的基因进行PCR扩增，然后进行测序，最终得到了准确的狂犬病街毒株的全长序列。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下具体技术方案：

狂犬病街毒株HN10全基因组序列，该序列如序列表SEQ ID No.1所示，狂犬病街毒株HN10的基因组全长包括11923个核苷酸。

上述狂犬病街毒株HN10全基因组序列扩增引物，所述扩增引物如序列表SEQ ID No.2至SEQ ID No.49所示，共24个引物对。

一种制备上述狂犬病街毒株HN10全基因组序列的方法，其具体步骤如下：

(1)病毒的分离；

(2)病毒RNA的提取；

(3)病毒RNA的逆转录；

(4)引物合成如SEQ ID No.2至SEQ ID No.49所示，针对所示引物将病毒基因组序列分段，分为24个段；

(5)利用SEQ ID No.2至SEQ ID No.49所示引物分别对分段基因序列进行目的基因的PCR扩增；

(6)目的基因片段的回收；

(7)目的基因序列测序。

所述步骤(1)病毒RNA的提取具体步骤为：取经BHK-21细胞传至第四代的病毒HN10，反复冻融3次；离心，取病毒悬液，先加入0.2ml总RNA提取试剂(TRIzol LS Reagent)匀浆后，再加入0.8ml总RNA提取试剂(TRIzol LSReagent)，混匀；-20℃放置30min，加氯仿，混匀，室温放置5min，离心；取离心后上层水相，加入与上层水相等体积的异丙醇，混合，室温放置10min；离心，弃上清，留沉淀，加入75％冰预冷的乙醇，振荡洗涤，离心，弃上清，室温干燥沉淀后将沉淀溶于无核酸酶的超纯水中。上述步骤中离心均在4℃下。

所述步骤(2)病毒RNA的逆转录具体步骤为：将随机引物稀释至0.2μg/μl，取33μl总RNA液，65℃水浴10min，取出后立即冰浴，离心，将32μl液体转移至cDNA第一链合成试剂(Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads)反应管中，再向反应管中加入1μl随机引物，使总体积达到33μl，室温1min，混匀，离心，37℃水浴60min，即得逆转录产物cDNA。

所述步骤(3)病毒基因组序列分段为：将步骤(2)病毒逆转录产物cDNA分为24个片段，每片段不超过1.1kb。

所述步骤(4)PCR扩增反应体系为：H₂O 34.5ul，10×Pfx扩增缓冲液5ul，10mM dNTP mix 1.5ul，50mM MgSO₄ 1ul，正向引物F 1ul，反向引物R 1ul，cDNA 5ul，Pfx DNA聚合酶1ul；

PCR循环条件参数：先用94℃ 2min进行一个循环，然后用94℃ 15sec；50℃30sec；68℃40sec进行35个循环，最后再进行一个68℃ 10min的延伸。