[发明专利]双表达盒的表达载体及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及双表达盒的表达载体及其制备方法与应用。

背景技术

哺乳动物细胞真核表达载体是基因工程技术中最常见的表达载体之一，被广泛的应用于科研、生产等领域。与原核蛋白表达载体相比，由哺乳动物细胞翻译的蛋白，经过翻译后的加工与修饰，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。目前在科研中真核蛋白表达质粒广为应用，如研究蛋白在哺乳细胞中的定位、DNA疫苗的研制等，而且许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和生产，有些产品已投入临床应用或试用。

目前使用的真核表达蛋白质粒在构建表达外源基因质粒的过程中，是通过传统的连接方法连接的，首先要选择合适的酶切位点，要求连接的外源基因片段中没有所选择的酶切位点，然后用限制性内切酶酶切载体与外源基因片段，再用T4DNA连接酶将载体与目的片段连接成一个完整的质粒。传统的这种酶切的连接方法存在步骤比较烦琐、成本高(需要购买内切酶与连接酶)，连接效率较低等问题，在构建过程中PCR产物与载体都要通过反复的酶切，电泳，回收等步骤，才能进行进一步的连接

发明内容

本发明的目的是提供一种双表达盒的表达载体及其制备方法与应用。

本发明所提供的双表达盒的表达载体，命名为pDP-EX-vector，是一种环状载体，包含原核复制起点、两个真核复制起点、筛选标记基因和两个外源基因表达盒；所述两个外源基因表达盒分别为外源基因表达盒1和外源基因表达盒2；所述外源基因表达盒1自上游至下游依次含有两个转录方向相同的启动子、连接片段1和多聚腺苷酸加尾信号，所述连接片段1含有EcoRV识别序列；所述外源基因表达盒2自上游至下游依次含有两个转录方向相同的启动子、连接片段2和多聚腺苷酸加尾信号，所述连接片段2含有StuI识别序列。

其中，所述外源基因表达盒1和所述外源基因表达盒2的转录方向可以相同也可以相反，优选所述外源基因表达盒1和所述外源基因表达盒2的转录方向相反。

所述两个转录方向相同的启动子可为多种启动子，具体可为巨细胞病毒启动子和T7噬菌体启动子。所述真核复制起点可为任何现已知的真核生物进行DNA复制的起始点，具体可为SV40病毒复制起点。所述多聚腺苷酸加尾信号可为具有终止转录作用的所有DNA片段，具体可为牛生长激素基因多聚腺苷酸加尾序列。所述原核复制起始位点可为任何现已知的原核生物进行DNA复制的起始点，具体可为大肠杆菌质粒CoIE1复制起始位点。

pDP-EX-vector的核苷酸序列具体可为序列表中的序列1。

用EcoRV或StuI酶切所述双表达盒的表达载体得到的线性载体也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供所述双表达盒的表达载体的构建方法。

本发明所提供的双表达盒的表达载体的构建方法，包括如下步骤：

1)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物：5’ACATGTTCTTTCCTGCGCCGCTACAGGG3’和5’GAATTCTGCAGATATCCTCGAGCATGCATCTAG 3’进行PCR扩增，得到片段A；

2)以pCDNA3.0质粒为模板，用如下引物：5’CTCGAGGATATCTGCAGATATCCAGCACAC3’和5’CCCTGTAGCGGCGCAGGAAAGAACATGT3’进行PCR扩增，得到片段B；

3)将片段A和片段B导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段A和片段B连接，获得重组载体I；

4)以重组载体I为模板，用如下引物：5’GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC3’和5’GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG 3’进行PCR扩增，得到片段D；

5)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物：

5’GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC 3’或5’

CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC 3’进行PCR扩增，得到片段C；

6)将片段C和片段D导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段C和片段D连接，获得重组载体II；

7)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物：5’

CGCCCTGTAGCGGCGATCCCGCCCCTAACTC 3’和5’

CTCACATGTTCTTTCCTGCAAAAGCCTAGGCCTCC 3’进行PCR扩增，得到片段F；