[发明专利]双表达盒的表达载体及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种环状载体，其核苷酸序列为序列表中的序列1。

2.一种线性的载体，是用EcoRV或StuI酶切权利要求1所述的载体得到的线性载体。

3.权利要求1所述载体的构建方法，包括如下步骤：

1)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物：5’ACATGTTCTTTCCTGCGCCGCTACAGGG3’和5’GAATTCTGCAGATATCCTCGAGCATGCATCTAG 3’进行PCR扩增，得到片段A；

2)以pCDNA3.0质粒为模板，用如下引物：5’CTCGAGGATATCTGCAGATATCCAGCACAC3’和5’CCCTGTAGCGGCGCAGGAAAGAACATGT 3’进行PCR扩增，得到片段B；

3)将片段A和片段B导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段A和片段B连接，获得重组载体I；

4)以重组载体I为模板，用如下引物：5’GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC 3’和5’GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG 3’进行PCR扩增，得到片段D；

5)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物：

5’GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC 3’或5’

CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC 3’进行PCR扩增，得到片段C；

6)将片段C和片段D导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段C和片段D连接，获得重组载体II；

7)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物：5’CGCCCTGTAGCGGCGATCCCGCCCCTAACTC3’和5’CTCACATGTTCTTTCCTGCAAAAGCCTAGGCCTCC 3’进行PCR扩增，得到片段F；

8)以重组载体II为模板，用如下引物：5’GAGTTAGGGGCGGGATCGCCGCTACAGGGCG3’和5’GGAGGCCTAGGCTTTTGCAGGAAAGAACATGTGAG 3’进行PCR扩增，得到片段E；

9)将片段E和片段F导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段E和片段F连接，获得重组载体III；

10)以重组载体III为模板用如下引物：5’CAATAATCAATGTCAACGCCTAGGCTTTTGCAGGA3’和5’GGTGGGCTCTATGGCTTCCCTCCAAAAAAGCCTCCTC 3’进行PCR扩增，得到片段H；

11)以PCDNA3.0为模板，用如下引物：5’GAGGAGGCTTTTTTGGAGGGAAGCCATAGAGCCCACC 3’与5’TCCTGCAAAAGCCTAGGCGTTGACATTGATTATTG3’进行PCR扩增，得到片段G；

12)将片段G和片段H导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段G和片段H连接，获得重组载体IV；

13)以重组载体IV为模板，以引物如下：

5’AAAGCAGGCCTTGTTTCTACTCTCGAGCATGCATCT 3’与5’

AACAAGGCCTGCTTTCGCTGATATCTGCAGAATTC进行PCR扩增，得到片段I；

14)将片段I导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组获得权利要求1所述的载体。