[发明专利]中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列、构建方法及其氨基酸序列和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种中国林蛙功能序列及其编码的蛋白序列，具体地说是一种中 国林蛙功能基因Rd-RNase2序列及其编码的氨基酸序列和其用途。

背景技术

全世界每年新诊断的癌症病例达1亿，每10万人中250人死于癌症，因此战胜 癌症是现代医药最重大的挑战之一。尽管外科手术可以治愈可切除的癌症，不可 切除的癌症只能采用化学治疗或放射治疗。常规药物用于治疗存在的主要问题 是，缺乏选择性，毒性强烈及外来蛋白的免疫原性，经常会导致副反应，如暂时 性腹泻、恶心、脱发、易感染。有时会对心、肺、肾、骨髓产生长期影响。

大多数降解DNA的药物所导致的凋亡与野生型p53肿瘤遏制物的存在与否 关系密切，在p53缺失的情况下，降解DNA的药物对肿瘤无效。目前人类的大部 分肿瘤(尤其是实质性肿瘤)都能通过变异使p53失活，或产生p53抗体。而且， 导致DNA损伤的药物往往能够使正常细胞产生基因变异。

因此需要开发毒性适度的、人类具有免疫耐受性的药物来解决这些问题。

RNases能够降解RNA引起细胞死亡，被认为是一种毒素。活细胞大约含有20种 外切和内切核糖核酸酶，把RNA处理为成熟形式并调控RNA转录。RNase参与RNA代 谢、细胞成熟、细胞生理死亡、促进血管生成，而且发挥抵御RNA病毒的宿主防 御功能。

当外源RNases进入细胞，它们可能通过降解RNA、削弱蛋白生物合成、引起凋 亡而杀死细胞。

实际上，已经发现多种核糖核酸酶在体外实验中具有细胞毒性，但在体内实 验中却毫无毒性。该家族的典型代表是牛胰腺核糖核酸酶(RNase A)，由于受到 哺乳动物体内普遍存在的核糖核酸酶抑制剂(RI)的作用，不具备抗肿瘤作用。 而从牛精液中发现的天然二聚体形式的核糖核酸酶(BS-RNase)，尽管与RNase A 的氨基酸序列相似性高达80％，但是不受RI的抑制作用，在体内外实验中均显示 出强大的选择性地抗肿瘤作用。BS-RNase不仅作用于肿瘤细胞，还具有胚胎毒性， 精子生成抑制，免疫抑制活性。EDN和ECP是来源于嗜酸性粒细胞的核糖核酸酶A 超家族成员，尽管序列相似，但是具有不同的功能。EDN具有抗病毒功能，而ECP 主要表现出强大的杀菌、杀寄生虫的功能。从家鸡(Gallus gallus)白细胞中 分离到两种核糖核酸酶RNases A-1和A-2，二者具有81％氨基酸序列相同，二者 都与人血浆核糖核酸酶抑制剂(hRI)相互作用。RNases A-2同时具有血管生成 活性和杀菌作用，RNases A-1没有这两种活性。目前的研究发现，核糖核酸酶A 超家族成员是一组快速进化的蛋白家族，不同的物种中核糖核酸酶序列的微小差 异导致功能的显著变化。

目前文献报道的蛙类核糖核酸酶抗肿瘤的研究，仅局限于豹蛙、牛蛙和日本 稻田蛙。不同蛙物种核糖核酸酶的氨基酸序列不同，结构的差异导致功能不同。

在两栖动物蛙属中，最早被鉴定的核糖核酸酶是Onconase，是1991年Ardelt 等从R.pipiens卵中基于其抗肿瘤作用而分离的蛋白。Onconase完整氨基酸顺序 的阐明，揭示出其属于核糖核酸酶A超家族。另外三种核糖核酸酶从蛙的卵和肝 被鉴定：牛蛙Rana catesbeiana(蛙卵rc-RNase，蛙肝rc-L1)日本稻田蛙Rana japonica(蛙卵rj-lec)。1998年Huang等首先分离出编码蛙核糖核酸酶的cDNA， 发现mRNA仅在雌蛙的肝脏表达，最终合成的蛋白定位于蛙卵细胞中。2000年Liao 等从蛙卵黄颗粒提取物和肝中分离出5个编码牛蛙R.catesbeiana核糖核酸酶的 cDNA序列(rc-01编码rc-L1，rc-02，rc-03，rc-04，rc-06)，2000年Chen等 从R.pipiens中发现了性别特异性的细胞毒性核糖核酸酶(rp-rap)。2001年 Rosenberg等以牛蛙Rana catesbeiana基因组DNA为模板，采用PCR得到了五个新 的蛙核糖核酸酶基因顺序(rc-203，rc-204，rc-208，rc-212，rc-218)。表明 来源于蛙属的核糖核酸酶基因通过正向选择快速分化的方式进化，暗示了这个独 特的蛋白家族可能具有新的生理功能。