[发明专利]中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列、构建方法及其氨基酸序列和用途

权利要求书

1.一种中国林蛙功能基因Rd-RNase2，其特征在于，其核苷酸序列为序列表 中SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。

2.一种中国林蛙功能基因Rd-RNase2编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸 序列为序列表中SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求1所述的中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列的构建方法， 其特征在于，其具体步骤为：提取出中国林蛙的基因组DNA，设计基因特异性引 物，进行PCR扩增，产物电泳；所述的基因特异性引物为序列表中SEQ ID No.3 和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，为正反引物对：

正向引物N275：TAT TTG CAG TTG TTT TGA GTC TCA C

反向引物C715：CTG CTT ATC ACA TCC CTG TTG TC

从电泳胶中回收目标DNA片段，与质粒连接，转移到细胞，提取质粒，PCR 初步鉴定目标基因后，测序。

4.根据权利要求3所述的中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列的构建方法， 其特征在于，所述PCR扩增的反应体系及参数：

基因组DNA、dNTPs、H₂O、10×Taq Buffer、Taq DNA Polymerase和基因特 异性引物至总体积50μl，混合均匀；

扩增条件为：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35个循环，72℃延伸7min结束。

5.根据权利要求3所述的中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列的构建方法， 其特征在于，所述与质粒连接的具体步骤为：

(1)目标DNA片断、载体、T4 DNA Ligase、10×T4DNA Ligase Buffer至 总体积10μl；

(2)16℃连接10～12小时制备成连接好目标基因的载体；

(3)对步骤(2)连接好的样品进行PCR检测；连接产物1μl、dNTPs、10×Taq Buffer 5μl、Taq DNA Polymerase3U和质粒通用引物各10pmol，补无菌超纯水 至总体积50μl，混合均匀；PCR扩增条件：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35个 循环，72℃延伸7min结束；

(4)2.5％TAE琼脂糖凝胶中上样电泳检测，紫外分析仪中，观察DNA条带。

6.根据权利要求3所述的中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列的构建方法， 其特征在于，所述转移到细胞的具体步骤为：

(1)将5μl目标基因与质粒连接的产物加入到100μl感受态细胞中，混 匀，冰浴30min；

(2)42℃水浴中热激90s；取出后立即置于冰浴2min；

(3)加入500μl提前37℃预热好的不含抗生素的LB培养基，37℃，150rpm 摇床培养45min；

(4)4000rpm离心2min，弃部分上清液，浓缩后取100μl涂转化平板，涂 匀，干燥，倒置平板，37℃恒温箱培养16h；

(5)挑取分离良好、中等大小的白色菌落接种到含有抗生素的LB液体培养 基中，摇床37℃、180rpm培养12h。

7.根据权利要求3所述的中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列的构建方法， 其特征在于，所述提取质粒后PCR初步鉴定的PCR反应体系及参数为：

提取的重组质粒、dNTPs、10×Taq Buffer、H₂O、Taq DNA Polymerase和引 物至总体积20μl，混合均匀；

PCR扩增条件：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35个循环，72℃延伸7min结 束。

8.一种权利要求1所述的中国林蛙功能基因Rd-RNase2序列的扩增引物， 其特征在于，为序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，为正 反引物。

9.权利要求2所述的中国林蛙功能基因Rd-RNase2编码的蛋白在制备治疗 抗胶质肿瘤药物中的应用。