[发明专利]布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒

权利要求书

1.一种布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒，其特征在于：它是利用平滑型布氏杆菌与粗糙型布氏杆菌的纯化脂多糖混合物作抗原包被酶标板，用S1119.3免疫健康牛制备阳性对照血清、标准弱阳性血清，用健康非免疫牛血清作阴性对照血清，以酶标记的与哺乳动物Fc段结合的受体--蛋白质AG作酶标记结合物，配以血清稀释液、洗涤液、底物溶液A、底物溶液B、H₂O₂、终止液，组装组成。

2.根据权利要求1所述的一种布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒，其特征在于所述的抗原包被酶标板制备方法如下：

(1)菌种

制作抗原用菌种分别为B.abortus S1119.3和B.abortus RB51；B.abortus S1119.3株在马铃薯浸液琼脂上，37℃经48小时孵育始能长出透明的、无色或浅黄色、边缘光滑的菌落，菌落直径1-2mm；B.abortus RB51株在马铃薯浸液琼脂上，37℃经48小时孵育始能长出透明度低、边缘粗燥、表面干燥的菌落，在折射光下呈暗白或黄色，菌落直径1-2mm；

(2)抗原

一级种子制备及鉴定：将冻干B.abortus S1119.3株和B.abortusRB51株用等量灭菌生理盐水溶解，分别接种马铃薯浸液琼脂斜面，在37℃培养48小时；观察菌落形态，分别选取光滑型和粗糙型培养特性的菌落，移植于含有5％小牛血清和0.1％酵母浸液的马铃薯浸液琼脂扁瓶，接种面向下于37℃温箱培养72小时，用0.5％苯酚生理盐水收获细菌培养物，进行生物纯度检验，合格的作为一级种子，置-20℃保存；

二级种子繁殖：

取两种菌株一级种子分别接种于马铃薯浸液琼脂37℃培养72小时，收获细菌培养物；分别进行形态和生化特性、培养特性、血清学特性、变异检查、纯净检验等检验；符合要求的菌种，置2℃～8℃保存；

(3)抗原制备

菌悬液制备：

分别将鉴定合格的B.abortus S1119.3株和B.abortus RB51株二级种子接种于含有5％小牛血清和0.1％酵母浸液的马铃薯浸液琼脂的扁瓶中，37℃培养72小时；经变异检查，将有杂菌污染或生长不典型的扁瓶弃去；吸弃扁瓶中凝集水，每瓶加入含有0.5％苯酚的生理盐水20ml，洗下培养物，收集于高压灭菌好的玻瓶中；将收集好的菌悬液加热到80℃，维持90分钟；存于4℃；对灭活菌液应进行活性检验，37℃温育10天后不应有细菌生长；

(4)抗原提取

分别将两种灭活菌液以3000g离心75分钟，收集沉淀；将50g湿重细菌加入170ml双蒸水，加热到66℃，然后加入66℃的90％苯酚溶液；66℃持续搅拌15分钟，于4℃以10,000g离心15分钟；用一长管吸弃下层棕红色的酚相，必要时，用Whatman 1号滤纸过滤去除大菌体碎片；然后加入500ml含有1％饱和醋酸钠的冷甲醇，4℃孵育2小时，10000g离心10分钟，弃上清，将沉淀用80ml双蒸水重悬，18小时后，4℃10,000g离心10分钟；上清液于4℃保存；将沉淀悬浮于80ml灭菌蒸馏水，于4℃再搅拌2小时；依上法离心获上清液，并与前述上清液混合；随后，在上清液中加入8g三氯乙酸，室温搅拌15分钟后，按10,000g离心15分钟，弃去沉淀，上清液以蒸馏水透析过夜，换液2次(每一次至少4000毫升)，然后将透析袋内容物-粗抗原冻干；

(5)抗原包被板

抗原包被板的制备：

包被无菌条件下，将两种纯化的冻干抗原用蒸馏水悬浮到冻干前的体积，按1∶5的比例混合光滑型与粗糙型抗原，再用0.05M pH9.6的碳酸缓冲液按1∶1000稀释，以100μl/孔，包被聚苯乙烯96孔板(NUNC620或同等材料)，加盖于4℃温孵18小时；

洗涤  以0.01mol/l pH值为7.2的PBST(见5洗涤液)作洗涤液，加入足量室温作用3分钟后甩去，如上重复3次，或用洗板机重复洗3次，拍干至无水印为止；

封闭  用含0.1％牛血清白蛋白的0.01mol/l  pH值为6.3的PBST(见4血清稀释液)按100ul/孔，加入至酶标板中，37℃作用1小时，甩去，加入足量洗涤液，室温作用3分钟后甩去，如上重复3次，或用洗板机重复洗3次，拍干至无水印为止，自然干燥。