[发明专利]一种牛传染性鼻气管炎疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种牛传染性鼻气管炎疫苗，其特征在于所述病毒为牛传染性鼻气管炎病毒，Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus，简称IBRV，系从牛传染性鼻气管炎流行地区分离鉴定。

2.根据权利要求1所述的牛传染性鼻气管炎疫苗，其特征在于所述牛传染性鼻气管炎病毒对乙醚、氯仿和胰蛋白酶敏感；不耐酸碱，用0.1mol/LNaOH和0.1mol/L HCl溶液将病毒液分别调到pH3，pH9和pH11，37℃作用1h，即可将病毒灭活；可被IBRV阳性血清中和，中和抗体滴度为2^-7.9；TCID₅₀值为10^-6.65/100μl，10^-3.35/20μl。

3.根据权利要求1所述的牛传染性鼻气管炎疫苗，其特征在于所述牛传染性鼻气管炎病毒可以用IBRV特异性引物经PCR扩增出339bp的gB基因的高保守区序列。

4.根据权利要求3所述的牛传染性鼻气管炎疫苗，其特征在于所述的IBRV特异性引物序列为

PB1：5′-GGC TCT ACC GCA CGG GCA CCT CT-3′；

PB2：5′-GCG GCT CTC GTC TCG CAG CAT TT-3′。

5.一种牛传染性鼻气管炎疫苗制备方法，其特征在于所述制备方法包含如下步骤：

a.病毒分离：无菌采集IBR流产胎牛的肝、脾、心、肾、胎盘、肺，剪碎、研磨，随后加入5倍量Hanks(内含200IU/ml青霉素和200μg/ml链霉素)，制成乳剂后移入10ml离心管中，反复冻融三次。以3000r/min离心10min，取上清液过滤除菌。用Hanks液稀释10倍、100倍、1000倍，分别接种长成致密单层且形态完好的犊牛睾丸原代细胞，连续传代35-50代分离得到。

b.病毒鉴定：用特异性的抗IBRV标准阳性血清与分离病毒进行中和试验，IBRV标准阳性血清对分离株的中和抗体滴度为2^-8.1；提取分离病毒DNA模板，用IBRV特异性引物经PCR扩增出339bp的gB基因的高保守区序列，证实分离的病毒为IBRV。

c.病毒繁殖：将毒种接种长成致密单层且形态完好的犊牛睾丸原代细胞，适时收获，测定效价，效价达到10^6.5TCID₅₀/0.1ml的毒液用于制苗。

d.灭活乳化：毒液中加入37％甲醛溶液使终浓度达到2‰，灭活12小时，按4％加入吐温-80，与含有1％硬脂酸铝、6％司班-80熬制而成的白油按体积比1∶2混合，经高速剪切乳化机10000转/分钟乳化15分钟制成油乳剂灭活疫苗。

6.根据权利要求5所述的牛传染性鼻气管炎疫苗制备方法，其特征在于所述疫苗制备方法适用于所有牛传染性鼻气管炎分离毒株的疫苗制备。

7.根据权利要求5所述的牛传染性鼻气管炎疫苗制备方法，其特征在于所述疫苗制备过程中可加入任意免疫增强佐剂。