[发明专利]一种抗农药敌百虫的特异性抗体

说明书

技术领域

本发明涉及选择一种具有-COOH的、又最大可能包含敌百虫原有结构的化合物作为敌百虫半抗原，并将半抗原制成抗原、进而产生抗体；以及此类半抗原、抗原的合成与抗体制备方法。本发明属于生物技术领域。

背景技术

随着现代农业的发展，农药一方面在农业生产中发挥着越来越重要的作用，另一方面，农药的不合理使用也导致了严重的农药残留超标问题，严重影响人们的身体健康和农产品出口贸易。敌百虫是一种水溶性的杀虫剂，纯品为白色结晶粉末，对高等动物和昆虫间表现了突出的选择毒性。而且，敌百虫还是敌敌畏的前体物质，在碱性介质中，易脱去氯化氢分子重排变为毒力较大的敌敌畏。我国对于敌百虫在农产品中的残留量，有较为严格的标准。按照GB2763-2005的规定：稻谷≤0.1mg/mL，小麦≤0.1mg/mL，水果≤0.1mg/mL，蔬菜≤0.1mg/mL。

然而，目前敌百虫农药及其代谢产物，由于其分子量为257.5，小于1000dolton(道尔顿)，一般传统上采用气相色谱(GC)、液相色谱(HPLC)或质谱等物化方法对其残留进行检测。虽然这些传统的理化分析方法灵敏度较高，而且较为准确，但由于它们普遍操作繁琐复杂、成本较高、分析速度慢，所以难于满足实际分析的需要，因此迫切需要发展一种简单、快速、灵敏的分析技术。

而免疫分析技术正是一种快速、灵敏、操作简单、费用低的检测技术。其基本原理认为：抗原抗体的免疫反应涉及分子间的立体结构，电荷、氢键及范德华引力作用等诸多因素，具有极高特异性和灵敏性，遵循质量作用定律，不仅可体内进行，也可体外进行，这些特点使其能被利用建立免疫分析方法，可达到传统理化分析技术无法达到的选择性和灵敏度。所以，免疫分析为敌百虫残留研究提供了一条新的分析检测途径。

发明内容

本发明设计合成了小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的标记物的放大作用，从而定性定量的检测样本中超微量小分子目标物，可用于样本测定。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和全抗原及抗体的制备。

本发明为达到以上目的所设计的技术方案是合成分子结构式如下图所示的敌百虫半抗原

，然后将半抗原与载体蛋白联接合成人工抗原，免疫动物，获得抗体。

(1)敌百虫原料[(2，2，2-三氯-1-羟基乙基)磷酸二甲基酯]与丁二酸酐在无水吡啶中反应，生成化合物2，2，2-三氯-1-(二甲氧基磷酰基)-乙基单酯琥珀酸，投料比为1∶1～10，室温反应12～36小时。反应完毕后，除去吡啶用浓盐酸与水1∶2～20的溶液酸洗，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠除水，蒸除乙酸乙酯得目标产物。采用重结晶方法进行纯化，得到较纯地目标产物。

(2)、化合物2，2，2-三氯-1-(二甲氧基磷酰基)-乙基单酯琥珀酸和N-羟基琥珀酰亚胺(即NHS)N-羟基琥珀酰亚胺(即NHS)在无水二氯甲烷中反应，冰浴下搅拌反应0.5～2小时后，在氮气保护下逐滴滴加溶有DCC的无水四氢呋喃，投料比为1∶2～4∶2～5，继续在冰浴下搅拌反应1～4h，然后自然升至室温搅拌过夜。终止反应后，过滤除去白色沉淀(即DCU)。经此部反应得到进一步完善的敌百虫人工半抗原活化酯{[2，2，2-三氯-1-(二甲氧基磷酰基)乙羰基]琥珀酸(2，5-二氧代环戊基)酯}。

通过配制适宜极性展开剂进行柱层析来进行纯化。其中展开剂配比为：乙酸乙酯∶正己烷＝2～6∶1，再加入约1％冰乙酸。

本发明还提供了上述敌百虫半抗原的用途，是用作动物免疫的抗原体系的原料。

(3)、人工抗原的合成：取半抗原[2，2，2-三氯-1-(二甲氧基磷酰基)乙羰基]琥珀酸(2，5-二氧代环戊基)酯溶于适量DMF中；将血兰蛋白溶于磷酸氢二钾溶液中，搅拌中，将半抗原反应液在冰浴下滴加入血兰蛋白溶液中，滴加完毕后3～5℃下搅拌反应过夜，然后将反应液装入透析袋，用0.01mol/L PBS溶液充分透析，得到DBC-KLH；

(4)、包被原的制备

用敌百虫活化酯与卵清白蛋白(OVA)连接即制成包被抗原，用于包被反应。

(5)、抗体的制备及纯化：

免疫动物选择日本大耳白兔2只，月龄3个月，体重1.5公斤左右，分别编号为1号、2号。免疫采取皮下和肌肉注射法共同进行。