[发明专利]一种抗农药敌百虫的特异性抗体

权利要求书

1.农药敌百虫的人工抗原和抗体其特征在于使用分子式为

的2，2，2-三氯-1-(二甲氧基磷酰基)-乙基单酯琥珀酸为半抗原与血蓝蛋白连接合成人工抗原，与辣根过氧化物酶连接合成酶标抗原，其中人工抗原再经过免疫新西兰大白兔，取血，分离出抗血清纯化制得抗体。

2.权利要求1所述的农药敌百虫人工抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

(1)半抗原2，2，2-三氯-1-(二甲氧基磷酰基)-乙基单酯琥珀酸的合成

敌百虫原料[(2，2，2-三氯-1-羟基乙基)磷酸二甲基酯]300mg加入到20mL含70mg丁二酸酐的无水吡啶溶液中，在隔离空气条件下室温搅拌反应10～22h，待反应停止后在30℃搅拌条件下进行减压抽干，除去吡啶；然后用浓盐酸与水之比1∶6～10的溶液酸洗涤后用乙酸乙酯进行萃取，合并有机相无水硫酸钠除水，减压条件下旋蒸除去乙酸乙酯即可合成敌百虫半抗原[2，2，2-三氯-1-(二甲氧基磷酰基)-乙基单酯琥珀酸]；

(2)半抗原活化酯的合成

在100mL圆底烧瓶中，敌百虫半抗原[2，2，2-三氯-1-(二甲氧基磷酰基)-乙基单酯琥珀酸]300mg加入到10mL溶有167mgN-羟基琥珀酰亚胺的无水二氯甲烷中，冰浴下搅拌反应30-60min后，在氮气保护下逐滴滴加3.5mL溶有207mgDCC的无水四氢呋喃，继续在冰浴下搅拌反应1～4h，然后自然升至室温搅拌过夜，终止反应后，过滤除去白色沉淀，得到敌百虫半抗原活化酯{[2，2，2-三氯-1-(二甲氧基磷酰基)乙羰基]琥珀酸(2，5-二氧代环戊基)酯}；

(3)人工抗原的合成

取半抗原活化酯[2，2，2-三氯-1-(二甲氧基磷酰基)乙羰基]琥珀酸(2，5-二氧代环戊基)5mg酯溶于适量250ul DMF中配置成A液，将15mg血兰蛋白溶于3mL磷酸氢二钾溶液中配置成B液，将A液在冰浴下滴加入B液中，滴加完毕后3～5℃下搅拌反应过夜，然后将反应液装入透析袋，用0.01mol/L PBS溶液充分透析，得到人工抗原。

3.权利要求1所述的农药敌百虫酶标抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

取权利要求2中所合成的半抗原活化酯1.67mg溶于2ml二甲基甲酰胺配成溶液A，0.51mg辣根过氧化物酶溶于2ml pH 7.4的0.2mol/L磷酸缓冲液配成溶液B，然后在冰浴下将溶液A缓慢的加入溶液B中，经搅拌后在4℃下反应过夜，最后将反应液置入透析袋中，在4℃下用pH7.4的0.2mol/L磷酸缓冲液透析三天即可得到酶标抗原，用于显色反应。

4.权利要求1所述的农药敌百虫抗体的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

免疫动物选用雌性新西兰大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后间隔一个月进行第五次免疫，免疫后9天由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测，具体做法是：

初次免疫：取1mg按照权利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，进行动物免疫；

加强免疫：用0.5mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所配制的溶液，进行动物免疫；

抗体纯化：定时监测动物抗体效价，当抗体对一定的包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用G-Sepharose蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，获得抗农药速灭威的特异性抗体。