[发明专利]一种糖尿病食疗酵母及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种糖尿病食疗酵母及其构建方法，属于生物技术领域。

背景技术

糖尿病是一种严重威胁人类健康和生命的代谢紊乱性疾病。就糖尿病患病人数而言，已经接近于流行的比例。目前，用于治疗2型糖尿病的药物中，除了磺脲类、二甲双胍、阿卡波糖以及噻唑烷二酮类等化学药物外，还包括肽类药物胰岛素。它们通过不同的机制来降低血糖，但是这些药物不能阻止β细胞的死亡或者促进β细胞的新生。所以，2型糖尿病患者使用上述方法治疗，依然无法避免β细胞功能持续下降。

胰高血糖素样肽-1(glucagons-like pepetade-1，GLP-1)是一种来自肠道L细胞加工分泌的多肽类激素，有望成为继胰岛素之后又一种治疗糖尿病的重要多肽类药物。研究表明，GLP-1具有增加外周细胞胰岛素受体对胰岛素敏感性；改善β-细胞功能，增加β-细胞数量；促进胰岛素原合成，胰岛素分泌，降低血糖和糖化血红蛋白，抑制胰高血糖素分泌等功能(Endocr.Rev.，May 1，2008；29(3)：367-379，PNAS，September 5，2006；103(36)：13468-13473.，Diabetes Care，October 1，2004；27(10)：2554-2559，Lancet 2002；359：824-830，Endocrinol，1992，130：159-166，Diabetes，1989，38(3)：338-342，Endocrinology，1995，136：4910-4917，Euro J Endocrinol，2000，143：717-725，J Clin Invest，2000，105：955-965，Diabetes，1999，48：2270-2276，Endocrinology，2003，144(4)：1444-1455，Endocrinology，2003，144(12)：5149-5158，J Clin Invest，1993，91：301-307，Diabetes，1989，38：902-909，Diabetologia，1993，36：741-744，Diabetes，1989，38：902-909)，并且上述功能是血糖依赖性的，不会产生糖尿病治疗中最严重的急性低血糖等副作用。但是，由于受到血浆中二肽基肽酶(DPP-IV)降解作用，天然GLP-1在血浆中的半衰期很短，无法实现临床应用。因此，众多研究者采取改变天然GLP-1中受该酶作用的氨基酸位点来抵抗二肽酶降解的策略(No.5118666，WO90/11296，PCT/US89101121)，以延长GLP-1半衰期。

肽类药物的制备除了化学合成技术以外，还可以用DNA重组技术。据报道，已有的利用生物细胞表达GLP-1或者GLP-1类似物的专利包括：CN1363654A(利用大肠杆菌包内表达GLP-1(7-36))，CN1865430A(利用毕赤酵母表达GLP-1类似物)以及US6110703(利用酿酒酵母表达GLP-1)。

然而，上述表达策略是针对GLP-1(或者GLP-1类似物)单分子表达，以及以获得单分子蛋白为主要目的。本发明则旨在通过在酿酒酵母中表达十拷贝串联长效胰高血糖素样肽-1，以提高长效胰高血糖素样肽-1表达效率(rolGLP-1)，并最终以口服表达rolGLP-1的重组酿酒酵母来治疗2型糖尿病为目的。此外本发明利用DNA合成技术，既将天然GLP-1中的胰蛋白酶水解位点去除又将其中的DPP-IV水解位点去除，这样既避免了表达产物在肠道内被降解失活的可能，又延长了其在体内的半衰期，确保了降低血糖的长效性。

发明内容

本发明的第一个目的是构建一种稳定表达长效胰高血糖素样肽-1的重组酿酒酵母。

本发明所构建的重组酿酒酵母，是将十拷贝串联的rolGLP-1编码基因导入酿酒酵母BJ2407，得到稳定表达十拷贝rolGLP-1融合蛋白的菌株；所述rolGLP-1编码基因的核苷酸序列通过DNA合成技术将天然GLP-1第8、26和34位氨基酸替换后获得；所述十拷贝rolGLP-1编码基因的核苷酸序列是先根据rolGLP-1编码基因的核苷酸序列合成两种类型核苷酸序列以及前后两种补平用引物片段，进而利用合成的核苷酸序列进行分步退火一步连接后获得。十拷贝串联的rolGLP-1编码基因表达单元的两端分别连接有选自酿酒酵母核糖体RNA基因(rDNA)序列(GenBank编号为NC001144)29813-30888位以及30889-31728位的核苷酸序列。