[发明专利]一种糖尿病食疗酵母及其构建方法

权利要求书

1.一种重组酿酒酵母，是将一种治疗糖尿病的多肽——长效胰高血糖样肽-1(rolGLP-1)的编码基因以同向串联方式导入到酿酒酵母BJ2407中，得到稳定表达rolGLP-1的菌株；所述串联rolGLP-1基因的编码DNA碱基序列为：

编码的氨基酸序列通式为：[His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-The-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Gln-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Asp-Gly-Arg]_n，n＝1-10。

2.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于：串联的基因中，每个rolGLP-1基因其C端的Arg恰好是胰蛋白酶识别位点，保证融合蛋白口服后被胰蛋白酶分解为rolGLP-1单体发挥功能。

3.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于：利用DNA合成技术将天然胰高血糖样肽-1的第8、26、34位的Ala、Lys、Lys分别替换为Ser、Gln、Asp。从而消除了天然胰高血糖样肽-1内的二肽基肽酶(DPP IV)和胰蛋白酶识别位点。rolGLP-1具有如下的编码DNA碱基序列：

10        20         30         40         50         60         70         80         90

CATTCTGAGG GAACATTCAC ATCTGATGTA AGTTCTTACC TCGAGGGCCA AGCAGCTCAA GAATTCATCG CTTGGCTCGT AGATGGCCGT

GTAAGACTCC CTTGTAAGTG TAGACTACAT TCAAGAATGG AGCTCCCGGT TCGTCGAGTT CTTAAGTAGC GAACCGAGCA TCTACCGGCA

以及氨基酸序列：[His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-The-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Gln-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Asp-Gly-Arg]。

4.一种构建权利要求1所述重组酿酒酵母所需要的整合型载体的构建方法，是通过PCR的方法分别扩增两段酿酒酵母核糖体RNA基因(rDNA)序列(GeneBank编号为NC001144的29813-30888以及30889-31728)，酿酒酵母乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶基因URA3(GeneBank编号为NP010893)以及来自质粒pYX212的表达元件(TPI表达盒)，并将各DNA序列分别克隆到质粒pUC18的SacI/EcoRI、PstI位点、SalI/XbaI和XbaI/KpnI位点，得到整合型载体pNK1。

5.一种构建权利要求1所述重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于：将权利要求1中的串联rolGLP-1基因克隆到权利要求4中所构建的整合载体pNK1中，得到表达载体pNK-GLP，再通过限制性内切酶线性化pNK-GLP，并用线性化载体转化酿酒酵母。

6.根据权利要求1-5所述，构建表达rolGLP-1的重组酵母作为一种口服制剂用于预防和治疗糖尿病。

7.根据权利要求6所述用途，用于糖尿病病人的治疗方法，或者作为药物组合物的一个组分。