[发明专利]卷烟主流烟气基因毒性测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及卷烟主流烟气基因毒性评价领域，具体说是一种卷烟主流烟气基因毒性测定方法，是通过将细胞暴露于卷烟主流烟气下，测定主流烟气引起的细胞微核增加的比例来进行基因毒性测定。

背景技术

卷烟烟气是由几千种化学物质组成的气溶胶，其中许多组分对于细胞或人体都具有一定的毒性作用。科学家们开展了很多关于卷烟烟气或烟气中的化学成分的基因毒性研究，CORESTA体外毒理学特别工作组推荐选用合适的哺乳动物细胞用微核实验方法评价卷烟烟气的基因毒性。基因毒性测试的目的主要是测试外源性物质对于DNA的结构或功能潜在的负面作用。目前，基因毒性已经被公认与动物和人类的癌症紧密相关。微核实验是化学物质或混合物的基因毒性测试中应用最为广泛的一种。文献报道暴露于烟气冷凝物的V79细胞中均可以明显观察到微核的增加[参考文献1：Channarayappa，J Nath，T Ong.Clastogenic and aneuploidogeniceffects of cigarette smoke condensate，Mitomycin C and vincristine sulfate[J].Mutagenesis，1992，7(6)：457-260.参考文献2：Veltel D，A Hoheneder.Characterization of cigarettesmoke-induced micronuclei in vitro[J].Exp.Toxic Pathol，1996，48：548-550.]。此外在暴露于烟气冷凝物的BALB/c-3T3细胞中也可以明显地发现微核的增加[参考文献3：MooreM M，Honma M，Clements J.Mouse lymphoma thymidine kinase locus gene mutation assay：InternationalWorkshop on Genotoxicity Test Procedures Workgroup Report[J].Environmental and Molecular Mutagenesis，2000，35：185-190.]

但以上研究测试的对象为主流烟气粒相物，将主流烟气用剑桥滤片进行捕集，然后将捕集到剑桥滤片的主流烟气粒相物进行萃取，再进行微核测试。这样的测试方法要花费大量的时间，操作繁琐，且由于测试的只是卷烟主流烟气粒相物，没有测试主流烟气中的气相组分，不能反映真实地主流烟气基因毒性。

发明内容

本发明的目的正是针对上述现有技术仅仅测试捕集到剑桥滤片上的主流烟气粒相物对细胞的基因毒性的不足，而专门开发的一种用于卷烟主流烟气基因毒性测定方法，本方法还可省略烟气收集后进行繁琐的溶剂萃取过程，可以直接并全面的反映卷烟主流烟气的基因毒性，该方法操作简单，灵敏度高，结果可靠。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：先将培养好的细胞直接置入经过洁净空气稀释的卷烟主流烟气中进行暴露，暴露过的细胞经培养、离心和冷甲醇固定，然后用吖啶橙溶液荧光染色，先在低倍镜(10倍)下进行观察，选择分布均匀，染色较好的区域，再在荧光显微镜下计数，每个样品计数500个细胞中含微核(包括单核、双核和多核)的细胞数量，与洁净空气暴露的对照样品比较，判断卷烟主流烟气引起细胞微核增加的数量，进而判断卷烟主流烟气的基因毒性的大小。

本发明的具体测定方法包括以下步骤：

a.细胞培养：将测试细胞接种于细胞培养液中，在CO₂细胞培养箱中37℃下培养，当细胞繁殖到一定浓度时计数，并将细胞转移至T-75mL培养瓶中，浓度为5.0×10⁵-10.0×10⁵细胞/瓶，添加培养液至总体积20mL，于CO₂细胞培养箱中37℃下培养24h；

b.+S9组细胞培养：每个培养瓶吸出10ml培养液，用这些培养液配制S9混合物(53ml培养液+45ml NADPH(辅酶II)+2ml S9肝组织匀浆液)，每个培养瓶加入10ml S9混合物；