[发明专利]卷烟主流烟气基因毒性测定方法

权利要求书

1.一种卷烟主流烟气基因毒性测定方法，其特征在于：该测定方法包括以下步骤：将培养好的细胞直接置入经过洁净空气稀释的卷烟主流烟气中进行暴露，暴露过的细胞经培养、离心和冷甲醇固定，然后用吖啶橙溶液荧光染色，先在低倍镜下进行观察，选择分布均匀，染色较好的区域，再在荧光显微镜下计数，每个样品计数500个细胞中含微核的细胞数量，与洁净空气暴露的对照样品比较，判断卷烟主流烟气引起细胞微核增加的数量，进而判断卷烟主流烟气的基因毒性的大小；具体步骤如下：

a.细胞培养：将测试细胞接种于细胞培养液中，在CO₂细胞培养箱中37℃下培养，当细胞繁殖到一定浓度时计数，并将细胞转移至T-75mL培养瓶中，浓度为5.0×10⁵-10.0×10⁵细胞/瓶，添加培养液至总体积20mL，于CO₂细胞培养箱中37℃下培养24h；

b.+S9组细胞培养：每个培养瓶吸出10ml培养液，用这些培养液配制S9混合物，每个培养瓶加入10ml S9混合物；

c.细胞主流烟气暴露：在ISO标准条件下抽吸卷烟，产生的主流烟气用洁净空气稀释，烟气暴露浓度以稀释后的烟气中总粒相物(TPM)浓度为指标进行控制，稀释后的烟气直接导入长有细胞的包括-S9组和+S9组两组样品的培养瓶中进行主流烟气暴露，暴露时间为60min，整个暴露过程根据监测的TPM/L值进行控制，包括-S9组和+S9组两组样品的正常对照组通入洁净空气暴露；

d.微核测试：暴露过的细胞培养2h后，吸出培养液并分别用20ml预热的D-PBS漂洗2遍，加入3ml胰酶消化液，待细胞消化后加入2ml培养液，将细胞悬液转入离心管内，2000rpm离心5min，弃去上清液，加入1ml含6μg/ml细胞松弛素B的细胞培养液，混合均匀，进行细胞计数并计算出总细胞数量，加入含6μg/ml细胞松弛素B的细胞培养液调节细胞浓度0.1×10⁶细胞/ml，混合均匀后移取3.5ml至腔式载玻片，培养20h，除去培养液和腔体，用90％冷甲醇固定玻片10min，移去密封垫，自然晾干或风干，将风干的玻片在10mg/ml的吖啶橙溶液中浸泡3min，然后用蒸馏水冲洗玻片30s，黑暗处自然晾干或风干，先在10倍镜下进行观察，选择分布均匀，染色较好的区域，再在荧光显微镜下计数，每个样品计数500个细胞中含微核的细胞数量；

e.数据处理和分析，评价卷烟主流烟气基因毒性。

2.根据权利要求1所述的卷烟主流烟气基因毒性测定方法，其特征在于：S9混合物是由细胞培养液+NADPH(辅酶II)+S9肝组织匀浆液共同组成。

3.根据权利要求1所述的卷烟主流烟气基因毒性测定方法，其特征在于：S9混合物是由53％培养液+45％NADPH(辅酶II)+2％S9肝组织匀浆液混合而成。

4.根据权利要求1所述的卷烟主流烟气基因毒性测定方法，其特征在于：6μg/ml细胞松弛素B的细胞培养液是由细胞松弛素B和细胞培养液按比例混合配制而成。

5.根据权利要求1所述的卷烟主流烟气基因毒性测定方法，其特征在于：90％冷甲醇是由蒸馏水和甲醇按体积比配制并在冰箱-20℃保存。

6.根据权利要求1所述的卷烟主流烟气基因毒性测定方法，其特征在于：10mg/ml的吖啶橙溶液是由吖啶橙和D-PBS按比例配制而成。