[发明专利]雨生红球藻孢子破壁率的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于微藻生物技术领域，更具体设及一种雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)孢子破壁率的测定方法，准确、定量地反映雨生红球藻孢子粉有效成分虾青素(Astaxanthin)的生物可利用性，为雨生红球藻孢子粉生产过程的质量控制和产品流通过程的质量监管提供可靠的技术方法。

背景技术

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的孢子(cyst)是自然界含虾青素(Astaxanthin)最丰富的细胞，含量一般可达干重的1.5-3％，规模化养殖雨生红球藻是天然虾青素的主要来源[魏东，戚晓南.中国海洋药物.2001，83：4-8]。虾青素是一种天然类胡萝卜素，也是用于珍贵水产动物饲料添加剂的主要类胡萝卜素，具有改善食用鱼肉色和观赏鱼外观色泽的作用，仅三文鱼养殖，全球每年就需要大约130吨虾青素[Bjerkeng B.In：George Britton，Synnove Liaaen-Jensen，Hanspeter Pfander(Eds)：Carotenoids，Volume 4：Natural Functions.2008，Basel，P.237-254]。虾青素具有超强的抗氧化活性，抗氧化能力是天然β-胡萝卜和维生素E的数倍，具有极强的去除自由基的能力，保护细胞和组织免受脂质氧化的损伤，显著提高人体免疫力，具有抗疲劳、抗衰老作用[Guerin，M.et al.Trends Biotechnol.2003，21：210-216]。目前，天然虾青素已经被开发成为人类的保健食品。大规模培养雨生红球藻生产天然虾青素是二十一世纪国际上新兴的微藻生物技术产业。近年来，国内也开始批量生产雨生红球藻孢子粉。

无论作为水产动物的着色剂还是人类的保健食品，雨生红球藻孢子中虾青素能否发挥作用，首先取决于其生物可利用性，即能否被生物吸收利用[Castenmiller，M.；Waet，E.Pure appl.Chem.1997，69：1245-1250)。雨生红球藻的厚壁孢子非常坚韧，不易破碎，孢子壁虽然不能阻挡丙酮等小分子有机溶剂的渗透，但是可以完全阻挡虾青素分子的通过。所以，从红球藻孢子中提取虾青素需要首先破碎孢子的细胞壁。据报道，三文鱼缺乏消化红球藻孢子壁的酶，富含虾青素、但是孢子壁完整的雨生红球藻对三文鱼没有着色作用，只有将孢子壁破碎后，才能使三文鱼着色(Sommer，R.et al.Aquaculture.1991，94：79-88)。也就是说，无论动物还是人类，只能利用破壁的雨生红球藻孢子中的虾青素。所以，大规模培养雨生红球藻生产天然虾青素的一个关键步骤就是破碎孢子壁。

Mendes-Pinto等研究了高温(121℃)、酸(0.1M HCl)、碱(0.1M NaHO)、酶解(蛋白酶和崩溃酶)、喷雾干燥和高压均质对雨生红球藻虾青素提取的影响，研究表明，不同处理方法，提取效果悬殊很大。此研究仅利用扫描电子显微镜对红球藻孢子破碎情况进行了观察，未对孢子破壁率进行定量分析[Mendes-Pinto，M.et al.J.Appl.Phycol.2001，13：19-24]。周湘池等采用匀浆法、冻融法、超声破碎法、常温研磨法和低温研磨法五种破壁方法，从实验室培养的雨生红球藻鲜孢子中提取虾青素。结果表明，不同破壁方法，虾青素提取率差异很大。这项工作仅测定了虾青素的提取率，未涉及孢子破壁率的测定[周湘池等.海洋与湖沼，2006，37(5)：424-429]。欧阳琴等以实验室培养的雨生红球藻为材料，研究了高压均质法、超声破碎法和冻融法对雨生红球藻虾青素提取率的影响，同时测定了虾青素提取率和细胞破壁率。测定破壁率的方法是：利用“浮游生物计数框”，在显微镜下对破壁处理前的细胞进行计数，破壁处理后，再对剩余的完整细胞计数，用公式计算细胞破壁率：R＝(破壁前细胞数目-破壁后完整细胞数目)/破壁前细胞数目[欧阳琴等.福州大学学报(自然科学版)，2005，30(1)：111-114]。

计数法测定细胞破壁率，需要对比破壁处理前后完整细胞的数目，仅适用于在破壁处理的同时测定细胞破壁率。雨生红球藻孢子粉产品离开工厂生产线进入市场后，其破壁率的测定，细胞计数法就不适用了，因为不可能获得未破壁处理前孢子数目的信息。另一方面，在显微镜下观察，有时很难判断某些细胞是否完整，给细胞计数法测定破壁率带来困难。测定孢子破壁率，目的是为了定量反映红球藻孢子粉中虾青素的生物可利用性，所以，破壁率的测定方法需要建立在准确测定虾青素含量的基础上。