[发明专利]一种蛋白质混合物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及重组蛋白融合技术，具体地涉及一种蛋白质混合物。此外，本发明还涉及该蛋白质混合物的制备方法。

背景技术

1.人诱导多功能干(iPS)细胞

2006年，日本Yamanaka实验室利用逆病毒转导四种转录因子(KLF4，c-Myc，SOX2，OCT-4)进入小鼠胚胎和成年成纤维细胞，成功地获得了一种多功能干细胞，其特性与小鼠胚胎干细胞非常相似。不久，使用同样的方法转导人成纤维细胞，诱导的人多功能干细胞也被成功获得。随后，从多种遗传病病人细胞诱导的iPS cells也被获得。iPS cells具有与胚胎干细胞非常相似的特征，胚胎干细胞能够分化成所有类型的体细胞，这些分化的体细胞可以被用于修复由于疾病或受伤造成的组织损伤，因此胚胎干细胞在再生医学领域有非常广泛的应用前景。但是，胚胎干细胞在医学上的应用有两个重要的障碍：(1)移植后的免疫排斥；(2)使用人类胚胎的伦理学问题。即便使用体细胞核转移的方法获得的胚胎干细胞，也存在伦理学方面的问题。而诱导的人多功能干细胞可以从病人细胞获得，不存在免疫排斥的问题。又由于不需要破坏人胚胎或者使用人卵细胞，因此不存在使用胚胎干细胞的伦理问题。这些优点使得iPS细胞技术有更好的再生医学应用前景。

2.诱导多功能干细胞的技术

最早人们在诱导多功能干细胞时，使用复制缺陷的逆转录病毒或慢病毒载体将所需的重编程因子基因导入细胞，这些病毒载体都会整合到宿主细胞的基因组中。虽然这些外源基因在iPS细胞中在绝大多数情况下是静默的。但是一旦被重新激活，可能会导致肿瘤。这些基因的泄漏表达，也有可能使iPS细胞分化和成熟的不完全，导致形成未成熟的畸胎瘤危险性大增。病毒整合也有可能激活或终止内源基因的表达。在基因治疗的历史上，使用逆转录病毒整合技术也曾由于激活原癌基因导致白血病。许多实验室都尝试使用非病毒整合技术诱导多功能干细胞。腺病毒和质粒以及质粒都曾被用来载体将重编程因子导入细胞，成功获得iPS细胞。但是iPS细胞产生的机率非常低。OriP/EBNA-1质粒附加体也被用来作为载体来诱导iPS细胞。有一些实验室利用Cre/loxp，转座子/转座酶，在获得iPS细胞之后，将整合到基因组的外源基因切除。另外一种避免外源基因基因组整合的方法是用化学物质来代替重编程转录因子，从目前已发表的结果来看，还没有找到能完全替代重编程转录化学物质或组合，只能替代一到两种重编程因子。即使iPS细胞没有整合的外源基因，上述方法也不能完全避免基因组的改变，比如用质粒转化的方法会有低机率的基因组整合，化学物质可能会导致突变。

3.蛋白转导

蛋白转导最初来自于对于HIV TAT蛋白的研究，人们发现全长HIV TAT蛋白能够进入细胞激活病毒基因的转录。进一步研究表明，HIV TAT蛋白的一个区域(TAT PTD)负责进入细胞的功能。人们发现将TAT PTD与大分子偶联或融合能够将大分子送入细胞。研究表明带正电荷的精氨酸对于TAT PTD穿膜进入细胞质是必须的，任何一个精氨酸的突变都会导致转导功能的丧失。在此基础上，人们发现多聚精氨酸同样具有转导的功能。利用TAT PTD和其他蛋白转导多肽的蛋白质转导技术在解决于大分子药物进入细胞发挥功能方面具有巨大的潜力。

4.SUMO融合蛋白的切割

泛肽样修饰物(SUMO)能够共价修饰蛋白。SUMO修饰能够调控多种细胞进程包括核转移，信号转导和蛋白稳定性。Ulp1，一种SUMO蛋白酶，能够特异性地识别SUMO的三级结构，在SUMO与其修饰蛋白相连的位置切割。当SUMO与其他蛋白融合时(相当于SUMO修饰目标蛋白的N端氨基)，Ulp1也能特异性地将SUMO切除，将目标蛋白完整地释放。

5.蛋白诱导多功能干细胞