[发明专利]一种蛋白质混合物及其制备方法

权利要求书

1.一种蛋白质混合物，其特征在于，该蛋白质混和物由C-myc，SOX2，KLF4，OCT-4的融合蛋白组成，每一种融合蛋白的使用浓度为1ng/ml-1mg/ml；这些融合蛋白具有以下构成：PTD-SUMO-Protein；PTD是一个蛋白转导区，代表HIV-TAT，HSV-VP22，AntP或者多聚精氨酸；SUMO是泛肽样修饰物，代表酵母SMT3p或者其在各个物种的同源物，是融合蛋白进入细胞后被切割的识别区域；Protein是C-myc，SOX2，KLF4或者OCT-4。

2.如权利要求1所述的蛋白质混合物，其特征在于，所述蛋白转导区PTD为HIV TAT蛋白的TAT PTD区域，或者其他具有蛋白转导功能的氨基酸序列；该蛋白转导区PTD使该蛋白质混合物能够进入人细胞。

3.如权利要求1所述的蛋白质混合物，其特征在于，所述泛肽样修饰物SUMO为酵母SMT3p，或者其他氨基酸序列，其三级结构能被SUMO蛋白酶识别并切割，该泛肽样修饰物SUMO使蛋白转导多肽能够从融合蛋白切除。

4.如权利要求1所述的蛋白质混合物，其特征在于，在所述PTD和SUMO之间插入NES，所述融合蛋白具有以下构成：PTD-NES-SUMO-Protein，NES是一个可选的核运出序列，决定融合蛋白的细胞质定位。

5.如权利要求4所述的蛋白质混合物，其特征在于，所述可选的核运出序列NES为人IkBa的核运出序列，或者具有核运出序列功能的氨基酸序列。

6.如权利要求4所述的蛋白质混合物，其特征在于，所述PTD-NES-SUMO具有SEQ ID NO.1所示的DNA序列，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

7.如权利要求4所述的蛋白质混合物，其特征在于，所述PTD-NES-SUMO-SOX2具有SEQ ID NO.3所示的DNA编码序列；PTD-NES-SUMO-OCT-4具有SEQ ID NO.4所示的DNA编码序列；PTD-NES-SUMO-KLF4具有SEQ ID NO.5所示的DNA编码序列；PTD-NES-SUMO-C-myc具有SEQ ID NO.6所示的DNA编码序列。

8.如权利要求4所述的蛋白质混合物，其特征在于，所述PTD和NES之间插入6个组氨酸。

9.一种蛋白质混合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建PTD-NES-SUMO-Protein的表达质粒：首先，分别合成8段长为75bp 且相互间有20bp重叠的寡核苷酸引物，经过三次重叠PCR，合成PTD-NES-SUMO；然后，从人胚胎干细胞总RNA中扩增得到人OCT-4，SOX2，KLF4，C-myc cDNA，3’端含有XhoI位点，与合成的TAT-NES-SUMO的顺序通过PCR进行组装，获得的产物克隆到pET-24a(+)载体的NdeI/XhoI位点上；

(2)筛选表达菌株：将步骤(1)得到的PTD-NES-SUMO-Protein表达质粒转化到BL21宿主菌中，小量培养筛选高表达克隆；

(3)融合蛋白的大规模表达：将表达菌种接种于瓶中，培养至OD0.6，加入IPTG诱导3小时；

(4)分离纯化融合蛋白：采用疏水层析和离子交换来分离纯化上述融合蛋白。

10.一种如权利要求1-8任一项所述的蛋白质混合物在诱导人多功能干细胞中的应用。