[发明专利]一种利用酿酒酵母表达北非蝎毒素的方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，特别是涉及酿酒酵母表达北非蝎毒素的方法。

背景技术

黏虫(Mythimna seperata Walker)是鳞翅目昆虫，又称剃枝虫、行军虫，是我国粮食作物的重要害虫，每年南北往返迁飞，大发生时可把作物叶片食光，造成大面积减产或绝收，且其没有滞育、繁殖率高、体形较大，具有一定的代表性。在国内，许多农药研究机构将其作为新农药筛选的靶标。

目前，黏虫的防治措施主要是施用化学农药。然而化学农药的大量生产和使用又引出三大难题：(1)环境污染，残毒上升，人畜均遭毒害；(2)害虫抗药性直线上升，用药浓度不断提高；(3)杀伤天敌，破坏了生态平衡。(4)高残留的传统化学农药的使用已引起了农畜产品残留严重超标，导致出口受阻。这些都给生态环境、经济建设、食品安全、人民健康、城市品质和面貌带来了严重的危害。生物农药是直接利用生物产生的生物活性次生代谢产物或生物活体开发而成的农药。

生物农药主要包括生物化学农药(生物源农药)、微生物农药、转基因生物农药和天敌生物农药等四类。由于生物农药来源于自然，多数具有选择性强，对人畜等生物比较安全，环境相容性好，对天敌较安全，不易产生抗性，生产工艺比较简单，开发与登记费用较低等特点。

北非蝎毒素是从北非蝎子(Androctonus australis)中分离出的一种活性成分，是由70个氨基酸组成的多肽。AaHIT1毒素主要毒杀鳞翅目昆虫，特别对夜蛾科的一些重要的农作物害虫有效。它特异性地作用于昆虫神经系统，使昆虫产生收缩麻痹，而对甲壳动物、哺乳动物等其他动物均无毒性，具有高效、特异性强、安全性好等优点。

通过原核表达北非蝎毒素的工作正在进行中，目前存在的问题是表达产物的活性较低，主要原因在于AaHIT1是一段真核基因，真核基因在原核系统中表达容易出现包涵体、产生活性较低的表达产物。

酿酒酵母菌是基因工程中常用的一种宿主菌，重组酵母菌能够稳定地表达外源基因所编码的目的蛋白，并可对目的蛋白进行翻译后加工和修饰以产生功能性蛋白产物。而且具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物加工修饰及分泌的能力。酿酒酵母是与人们日常生活密切相关的益生菌，不会构成对环境的威胁；尽管本领域的研究人员能够按照现有基因工程原理推测北非蝎毒素基因作为真核生物的基因，应该在真核表达系统里表达时具有较高的活性，但至今还未能够找到一种利用酿酒酵母高效表达北非蝎毒素及利用其杀灭黏虫的方法。

发明内容

所要解决的技术问题

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用酿酒酵母表达北非蝎毒素的方法，以填补现有技术尚无法利用真核细胞高效表达北非蝎毒素的技术空白。

技术方案

本发明的技术方案之一是提供一种利用酵母菌表达北非蝎毒素的方法，依次包括如下步骤：

a)提供北非蝎毒素基因AaHIT1；

b)构建酵母细胞中表达AaHIT1蛋白的重组质粒pYES₂/AaHIT1；

c)将重组质粒pYES₂/AaHIT1转化酵母菌细胞；

d)筛选获得转化菌株AINVSC1并鉴定；

e)培养转化菌株AINVSC1，表达北非蝎毒素蛋白。

上述的利用酵母菌表达北非蝎毒素方法的优选方案之一为，所述的重组质粒pYES₂/AaHIT1含有GAL1启动子。

上述的利用酵母菌表达北非蝎毒素方法的优选方案之二为，所述的步骤e)中AINVSC1菌株的培养温度为20℃-37℃。

上述的利用酵母菌表达北非蝎毒素方法的优选方案之三为，所述的步骤e)中AINVSC1菌株的培养温度为28℃。

上述的利用酵母菌表达北非蝎毒素方法的优选方案之四为，所述的步骤e)中AINVSC1菌株的培养时间为14-28小时。

上述的利用酵母菌表达北非蝎毒素方法的优选方案之五为，所述的步骤e)中AINVSC1菌株的培养时间为20小时。

本发明的技术方案之二是提供一种北非蝎毒素，采用酿酒酵母菌表达，其制备方法依次包括如下步骤：

a)提供北非蝎毒素基因AaHIT1；

b)构建酵母细胞中表达AaHIT1蛋白的重组质粒pYES₂/AaHIT1；

c)将重组质粒pYES₂/AaHIT1转化酵母菌细胞；

d)筛选获得转化菌株AINVSC1并鉴定；