[发明专利]一种人脐带间充质干细胞库的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种干细胞库的构建方法，具体说是涉及一种人脐带间充质干细胞库的构建方法。 

技术背景

在人骨髓中除了存在人造血干细胞外，还有一类具有干细胞特征的细胞群体，被称为人间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。人间充质干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，在不同诱导条件下可分化为三胚层细胞，如骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞和神经细胞等。此外，MSCs还表达IL6、G-CSF和SCF等多种造血细胞生长所需要的因子，能够维持长期培养的造血祖细胞增殖，显示MSC具有支持造血和促进造血恢复的作用。同时研究表明MSC具有免疫调节作用，在体外能够抑制T淋巴细胞增殖，体内动物实验发现MSCs移植可以抑制异体免疫反应，减轻移植相关的排斥反应，并延长异体移植物的存活时间。最近的临床试验发现MSCs联合造血干细胞移植可以减轻GVHD并降低移植失败率。MSC的多向分化能力和免疫调节能力决定了其在细胞治疗、组织工程等领域具有广阔的应用前景。 

目前MSC的来源主要为成人骨髓。然而研究同时发现，人骨髓中MSCs含量极低，大约10⁴-10⁵个单个核细胞中才含有1个MSC，并且随着外科手术技术水平的提高，大创伤性手术越来越少，骨髓MSC来源越来越困难；另外，骨髓MSCs进行移植中可能存在的免疫排斥反应以及伦理道德将阻碍MSCs作为组织工程种子细胞的临床应用，因此，寻找新的MSCs来源成为目前国内外研究的热点。人脐带由于细胞原始、来源广泛、移植不涉及社会、伦理、法律等方面的争论，成为极好的MSC组织来源，本研究拟从人脐带中分离培养MSCs，拓展MSCs新来源。 

干细胞库是在-196℃液氮中储存干细胞或者相关资源的场所。目前干细胞库主要分为中华骨髓库和脐带血造血干细胞库。中华骨髓库主要开展造血干细胞捐献和移植治疗工作，负责造血干细胞捐献者资料库总体规划的制定和实施，开展志愿捐献者的宣传、组织、动员、HLA(白细胞抗原)分型，为患者检索配型相合的捐献者及移植相关服务等。脐带血造血干细胞库主要以人体造血干细胞移植为目的将新生儿脐带血采集后分离冷冻储存的干细胞库。目前国际通行的保存脐血干细胞的模式分为公共库和自体库两种模式。公共库的干细胞主要面向需要进行移植但自体干细胞没有被保存的病人；自体库则是在出生或健康时，将干细胞采集一部分予以保存，在自己或亲属生病时用来治病。但是，对于随同脐带血一同产生的脐带组织则被丢弃，其中包含的脐带间充质干细胞这不可复得的重要资源则白白丢失。

发明内容

本发明的目的在于提供一种步骤更少、操作更加简单、容易的方法来构建利用新生儿脐带为资源的脐带间充质干细胞库。 

本发明的技术方案概述如下： 

一种充分利用新生儿脐带为资源的脐带间充质干细胞库的构建方法，由下述步骤组成： 

(1)取人脐带进行ABO/Rh血型检测、HLA分型检测、微生物免疫检测、用缓冲液冲洗去除残留血液，剪碎，获得人脐带组织； 

(2)向步骤(1)所获得人脐带组织中加入1-3倍体积的0.05％-0.2％胶原酶消化，所述胶原酶消化温度为37℃，消化时间为2h，并获得消化后组织； 

(3)加入缓冲液稀释步骤(2)消化后组织，混匀、离心，离心力为600g，时间为15分钟； 

(4)弃上清，加入缓冲液重悬步骤(3)沉淀，过200目筛网，收集滤液，离心，离心力为450g，时间为10分钟，重复两次，即获得人脐带间充质干细胞； 

(5)将步骤(4)得到的人脐带间充质干细胞按2×10⁴/cm²接种于塑料培养皿，用含10％FBS的LG-DMEM培养基，置37℃、5％CO₂培养箱培养， 2天后换液，弃去非贴壁细胞，以后每3天后换液，待细胞80％汇合，0.25％胰酶消化，按1∶3传代，扩增后得到大量(1×10¹⁰)人脐带间充质干细胞用于科学研究和临床治疗，并用冷冻保护剂预处理，分装放入冻存管，所述冷冻保护剂由10％DMSO、10％右旋糖苷和80％LG-DMEM组成。 

(6)将步骤(5)获得的人脐带间充质干细胞置液氮保存，按其ABO/Rh分型和HLA分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出人脐带间充质干细胞库。 

优选地，所述缓冲液为磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液pH值为7.2-7.4。